Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Albert  B. Arul; Ren&#227; A.S. Robinson

doi:10.3791/61342

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Chimica

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

Published: December 18, 2020

doi:

10.3791/61342

Albert B. Arul¹, Renã A.S. Robinson^1,2,3,4

¹Department of Chemistry,Vanderbilt University, ²Vanderbilt Memory & Alzheimer’s Center,Vanderbilt University Medical Center, ³Vanderbilt Brain Institute,Vanderbilt University Medical Center, ⁴Vanderbilt Institute of Chemical Biology,Vanderbilt University Medical Center

Summary

L’etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) è una strategia avanzata di multiplexing del campione in grado di aumentare il numero di campioni che possono essere analizzati contemporaneamente ai tag isobarici disponibili. L’incorporazione di una piattaforma robotica ha notevolmente aumentato la produttività sperimentale, la riproducibilità e l’accuratezza quantitativa.

Abstract

Abbiamo introdotto un flusso di lavoro di proteomica quantitativa ad alta produttività, etichettatura isotopica precursore combinata e tagging isobarico (cPILOT) in grado di multiplexare fino a 22 o 24 campioni con tag di massa tandem o tag isobarici N,N-dimetil leucine isobarici, rispettivamente, in un singolo esperimento. Questo multiplexing del campione migliorato riduce notevolmente i tempi di acquisizione della spettrometria di massa e aumenta l’utilità dei costosi reagenti isobarici commerciali. Tuttavia, il processo manuale di gestione dei campioni e le fasi di pipettazione nella strategia possono richiedere molto lavoro, richiedere molto tempo e introdurre la perdita di campioni e l’errore quantitativo. Queste limitazioni possono essere superate attraverso l’incorporazione dell’automazione. Qui abbiamo trasferito il protocollo cPILOT manuale a un dispositivo di movimentazione automatica dei liquidi in grado di preparare grandi numeri di campione (cioè 96 campioni) in parallelo. Nel complesso, l’automazione aumenta la fattibilità e la riproducibilità di cPILOT e consente un ampio utilizzo da parte di altri ricercatori con dispositivi di automazione comparabili.

Introduction

La proteomica basata sulla spettrometria di massa (SM) è uno strumento di ricerca indispensabile per identificare biomarcatori specifici della malattia, comprendere la progressione della malattia e creare lead per lo sviluppo terapeutico. Questo può essere ottenuto da una serie di campioni clinici correlati alla malattia come siero del sangue / plasma, fluidi prossimali e tessuti¹^,². La scoperta e la convalida del biomarcatore proteomica hanno recentemente guadagnato una considerazione significativa a causa della potenza delle strategie di multiplexing del^{campione 3,}⁴. Il multiplexing del campione è una tecnica che consente il confronto simultaneo e la quantificazione di due o più condizioni del campione all’interno di una singola iniezione MS⁵^,⁶. Il multiplexing del campione si ottiene codificando peptidi o proteine da più campioni con tag chimici, enzimatici o metabolici e ottenendo informazioni sulla SM da tutti i campioni in un singolo esperimento MS o MS / MS. Tra i tag isobarici disponibili ci sono reagenti di tagging isobarico (iTRAQ), tag di massa tandem commerciali (TMT) e reagenti isobarici sintetizzati internamente N,N-dimetil leucina (DiLeu) con capacità fino a 16-plex⁷ e 21-plex⁸, rispettivamente.

L’etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) sono una tecnologia avanzata di multiplexing del campione. cPILOT combina l’etichettatura isotopica del peptide N-termini con isotopi leggeri [−(CH₃)₂] e pesanti [−(¹³C²H₃)₂] a basso pH (∼2.5), che mantiene disponibile il residuo di lisina per la successiva etichettatura isobarica ad alto pH (8,5) utilizzando TMT, DiLeu, o tag iTRAQ³^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. Lo schema di doppia etichettatura della strategia cPILOT è descritto nella Figura 1 supplementare con due campioni che utilizzano un peptide di esempio. L’accuratezza e la precisione della quantificazione basata su TMT a livello ms² possono essere compromesse a causa della presenza di ioni co-isolati e co-frammentati contaminanti definiti come effetto di interferenza¹⁵. Questa limitazione nei rapporti di ioni reporter imprecisi può essere superata con l’aiuto di spettrometri di massa Orbitrap tribridi. Ad esempio, l’effetto di interferenza può essere superato isolando un picco in una coppia dimetilata al livello MS¹ nello spettrometro di massa, sottosottenendo il picco leggero o pesante alla frammentazione MS² nella trappola ionica lineare e quindi sottosottenendo il frammento MS^{2 più} intenso per HCD-MS³ per ottenere informazioni quantitative. Al fine di aumentare le possibilità di selezionare i peptidi senza ammine di lisina disponibili per generare ioni reporter, è possibile utilizzare anche un’acquisizione selettiva di MS³ basata sul frammento y-1 ed è un approccio che può comportare una maggiore percentuale di peptidi quantificabili con cPILOT⁹. La combinazione di etichettatura leggera e pesante aumenta le capacità di multiplexing del campione di un fattore 2 volte superiore a quello ottenuto con i singoli tag isobarici. Recentemente abbiamo utilizzato cPILOT per combinare fino a 24 campioni in un unico esperimento con reagenti DiLeu¹⁶. Inoltre cPILOT è stato utilizzato per studiare le modifiche ossidativi post-traslatori¹⁴ tra cui nitrazione proteica¹⁷, altri proteomi globali⁹, e ha dimostrato applicazioni su più campioni di tessuto in un topo del morbo di Alzheimer^{modello 11}.

La robusta preparazione del campione è un passaggio critico in un esperimento cPILOT e può richiedere molto tempo, laboriosa ed estesa. Il multiplexing del campione migliorato richiede un’ampia pipettazione e personale di laboratorio altamente qualificato, e ci sono diversi fattori che possono influenzare pesantemente la riproducibilità dell’esperimento. Ad esempio, è necessaria un’attenta manipolazione dei campioni per garantire tempi di reazione simili per tutti i campioni e per mantenere un pH tampone appropriato per campioni dimetilati leggeri e pesanti. Inoltre, la preparazione manuale da decine a centinaia di campioni può introdurre un elevato errore sperimentale. Pertanto, per ridurre la variabilità della preparazione del campione, migliorare l’accuratezza quantitativa e aumentare la produttività sperimentale, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro cPILOT automatizzato. L’automazione si ottiene utilizzando un dispositivo robotico di movimentazione dei liquidi in grado di completare molti aspetti del flusso di lavoro (Figura 1). La preparazione del campione dalla quantificazione delle proteine all’etichettatura peptidica è stata eseguita su un gestore liquido automatizzato. Il gestore automatico del liquido è integrato con un apparato a pressione positiva (PPA) per lo scambio tampone tra le piastre di estrazione in fase solida (SPE), lo shaker orbitale e un dispositivo di riscaldamento / raffreddamento. La piattaforma robotica contiene 28 posizioni di coperta per ospitare piastre e buffer. Ci sono due baccelli con pinza per trasferire le piastre all’interno delle posizioni del ponte: una testa di pipettazione a volume fisso a 96 canali (5-1100 μL) e sonde a volume variabile a 8 canali (1-1000 μL). La piattaforma robotica è controllata utilizzando un software. L’utente deve essere addestrato professionalmente prima di utilizzare il gestore liquido robotico. Il presente studio si concentra sull’automazione del flusso di lavoro cPILOT manuale, che può essere laborioso per l’elaborazione di più di 12 campioni in un singolo batch. Al fine di aumentare la velocità effettiva dell’approccio cPILOT¹¹, abbiamo trasferito il protocollo cPILOT a un gestore di liquidi robotici per elaborare più di 10 campioni in parallelo. L’automazione consente anche reazioni simili per ogni campione in parallelo durante varie fasi del processo di preparazione del campione, che ha richiesto agli utenti altamente qualificati di ottenere durante il cPILOT manuale. Questo protocollo si concentra sull’implementazione del dispositivo di movimentazione automatica dei liquidi per eseguire cPILOT. Il presente studio descrive il protocollo per l’utilizzo di questo sistema automatizzato e ne dimostra le prestazioni utilizzando un’analisi “proof-of-concept” a 22 plex degli omogeneati epatici del topo.

Protocol

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’Università di Pittsburgh. Un topo di controllo maschile (C57/BLJ) è stato acquistato commercialmente e ospitato nella Division of Laboratory Animal Resources dell’Università di Pittsburgh. I topi venivano nutriti con chow ad libitum di laboratorio di roditori standard e tenuti in un ciclo chiaro/scuro di 12 ore. Il tessuto epatico è stato raccolto e conservato a -80 °C. 1. Estrazione di proteine NOTA: questi passaggi vengono eseguiti manualmente. Lavare il fegato di topo (100 mg) con soluzione salina e omogeneato con 500 μL di urea da 8 M utilizzando un omogeneizzatore meccanico che utilizza la matrice di liscivia A per 4 m/s per 20 s.NOTA: In questo studio, gli inibitori della proteasi o della fosfatasi non sono stati aggiunti, ma possono essere aggiunti al tampone se necessario, sulla base dell’esperimento. Inoltre, le fasi di estrazione delle proteine possono essere regolate di conseguenza per vari tipi di campioni. Trasferire l’omogeneato tissutale in un nuovo tubo di microcentrifugo, risciacquare e combinare i tubi di lisciviatura con 100-500 μL di PBS con urea da 8 M. Centrifugare i tessuti omogeneizzati (12.800 x g,4 °C e 15 min) e raccogliere il supernatante.NOTA: Il resto dei passaggi viene eseguito sul gestore di liquidi robotici disponibile nel laboratorio dell’utente. Il gestore del liquido deve essere in grado di aspirare e erogare buffer da e verso i tipi di piastra specificati ANCI, con una partecipazione minima dell’operatore. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di acido bicinchoninico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. Accendere il PPA, il dispositivo di riscaldamento/raffreddamento e le pompe per vuoto e collegare tutti gli accessori con il gestore del liquido. Il gestore del liquido mostra una luce blu una volta collegato al computer e pronto per l’esercizio. Alla piastra di reagente 1 (piastra del pozzo 96), aggiungere 30 μL di 25 mM 1,4-ditiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL di cisteina e 25 mM 30 μL di iodoacetamide (AIA) alle file 1, 2 e 3, rispettivamente. Aggiungere 8 M urea e 20 mM Tris con 10 mM CaCl2 (pH 8.2) a una piastra del serbatoio. Aggiungere 500 μL di acido formico al 5% di acido formico a 2 mL di piastra del pozzo profondo, 20 μL di triptina alla riga 1 della piastra di tripside e posizionarlo nella posizione del ponte come specificato dal metodo.NOTA: IAA e tripside sono stati aggiunti alla piastra del pozzo 96 prima dell’aggiunta al campione. Aliquota 300 μL dell’omogeneato epatico in un tubo da 500 μL e posizionare su una piastra di pozzo profondo 2 ml e posizionarsi a 4 °C fino all’inizio del protocollo. Per questo esperimento, 22 aliquote sono state generate dal singolo omogeneato epatico.NOTA: Aggiungere uno standard interno di controllo della qualità (ad esempio, caseina alfa bovina o altre proteine esogene) con lo standard di rapporto 1 μg: campione proteico di 100 μg. Definire il volume di buffer da aggiungere agli esempi in base ai nomi e al valore delle variabili in base alla tabella 1. In base al BCA, immettere il volume del campione e del buffer di normalizzazione (8 M urea) in un foglio di calcolo e allegare al software(tabella 2).NOTA: Un’ulteriore diluizione con tampone può essere necessaria se la concentrazione proteica è troppo elevata. Le concentrazioni risultanti per il campione del tessuto epatico sono state di 10 μg/μL. Il volume dei tamponi è stato ottimizzato per la proteina 100 μg. Rimuovere i tubi campione da 4 °C, posizionarsi sulla posizione del ponte specificata del gestore automatico del liquido e lasciare riscaldare per 10 minuti. Aprire il metodo e seguire le istruzioni per posizionare i suggerimenti richiesti (1070, 90 e 230 μL) e il labware nelle posizioni desiderate. Una volta che tutti i labware e le punte sono a posto, controlla con il layout del mazzo finale e fai clic su Avanti per continuare il protocollo.NOTA: la configurazione guidata informa l’utente di aggiungere un volume di buffer richiesto al labware specifico a seconda del protocollo e della posizione del deck da mantenere. 2. Riduzione del campione, alchilazione e digestione Caricare 230 μL di punte e aspirare 90 μL di urea da 8 M dal serbatoio e erogare alla fila 1 della piastra nera del pozzo profondo 2 mL. Scaricare i suggerimenti. Ripetere questo passaggio fino ad aggiungere 8 M di urea a tutti i pozzi corrispondenti ai 22 campioni.NOTA: Il tampone di denaturazione srotola la struttura tridimensionale della proteina per produrre la struttura primaria in modo che la tripparina possa agire e rompere efficacemente la proteina. La pipetta a 8 canali può aspirare diversi volumi per gli 8 canali e può erogare in diverse posizioni nel labware. In questo passaggio tutti i canali aspiravano lo stesso volume definito nel software. Dopo aver aggiunto il tampone di denaturazione, caricare le punte da 90 μL e aspirare 10 μL (corrisponde a 100 μg) di omogeneato di fegato di topo utilizzando la pipetta a 8 canali nella piastra nera del pozzo profondo 2 mL. Scaricare i suggerimenti. Ripetere questo passaggio fino al trasferimento di tutti i 22 campioni. Dopo ogni trasferimento, eseguire un passaggio di miscelazione per aspirare e erogare tre volte 50 μL del contenuto del pozzo per garantire la miscelazione della proteina con il tampone per mostrare un rapporto 1:1.NOTA: Rimuovere il campione omogeneizzato di magazzino e posizionarsi in -80 °C. Per ridurre le proteine denaturate, caricare una fila di punte da 90 μL e aspirare 3 μL di DTT dalla piastra del reagente 1. Distribuire DTT alle file 1 e 2 della piastra nera da 2 mL e scaricare le punte.NOTA: La proteina: Il rapporto molare DTT è mantenuto a 1:40 per la riduzione dei legami disolfuro. Il calcolo del rapporto molare si basa sulla massa proteica dell’albumina siere bovina (BSA), che è 66,5 x 103 g/mol. Sigillare la piastra del campione con un foglio di alluminio e incubare a 37 °C per 600 s a 300 giri/min. Aggiungere 30 μL di 0,25 M IAM alla riga 3 della piastra di reagente 1 poco prima dell’uso e posizionare sul ponte. Sconsituare la piastra campione e tornare al ponte.NOTA: L’IAM è sensibile alla luce. Caricare una fila di punte da 90 μL, aspirare 6 μL di IAM dalla piastra del reagente 1 alla riga 3 e erogare alla riga 1 della piastra del campione. Scaricare i suggerimenti.NOTA: Il rapporto molare proteina: IAM viene mantenuto a 1:80 per ogni campione. Questa reazione deve essere fatta al buio. Sigillare la piastra campione e incubare a 4 °C per 30 min a 300 giri/min sul dispositivo di riscaldamento/raffreddamento.NOTA: La sigillatura della piastra viene eseguita per evitare che il campione si leggeri, evapori e si consegni dal pozzo. Smacchiare la piastra del campione e caricare una fila di punte da 90 μL e aspirare 5 μL di cisteina dalla piastra del reagente 1 alla riga 2. Distribuire alle righe 1 e 2 della piastra campione e scaricare le punte. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.NOTA: La proteina: Il rapporto molare L-cisteina viene mantenuto a 1:40. Posizionare la piastra campione sullo shaker orbitale per eseguire una scossa a tempo di 1800 giri/min per 30 minuti. Aggiungere 800 μL di tampone Tris da 20 mM con cacl2 da 10 mM (pH 8,2) a ciascun pozza di piastra del campione per diluire la concentrazione di urea a 2 M. Scaricare le punte.NOTA: L’attività della tripsiderina è ostacolata a concentrazioni di urea più elevate e quindi deve essere ridotta a meno di 2 M. Questo studio è stato eseguito con un rapporto molare proteina-tripside di 50: 1 per 14 h. Aggiungere 20 μL di tripina alla riga 1, colonna 1-12 di una piastra di pozzo 96 e posizionare in una posizione specificata sul ponte. Caricare una fila di punte da 90 μL, aspirare 2 μL di tripside dalla fila della piastra di tripina 1 e erogare alle file 1 e 2 della piastra del campione. Scaricare i suggerimenti. Sigillare la piastra e incubare per 14 ore a 37 °C a 600 giri/min sul dispositivo di riscaldamento/raffreddamento. Dopo l’incubazione, smastrare la piastra del campione e aggiungere il 5% di acido formico alla riga 3, colonna 1- 12 di una piastra di raccolta del pozzo profondo e posizionarla sul ponte specificato. Interrompere la digestione aggiungendo 150 μL di acido formico al 5% dalla riga 3 della piastra dell’acido formico e erogare per campionare la piastra alle file 1 e 2. Scaricare i suggerimenti. 3. Desalting fase 1 Desalt i peptidi con piastra SPE contenente 20 mg di materiale Targa C-18. Fissare il volume per ogni scambio tampone come 600 μL e fissare la pressione a 100 mbar. Caricare punte da 1070 μL e aspirare 600 μL di acetonitrile e erogare alle file 1 e 2 della piastra SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione. Utilizzando le stesse punte, aspirare 600 μL di acetonitrile e erogare alle file 1 e 2 di piastra SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione.NOTA: Il flusso può essere scaricato per i rifiuti utilizzando una pompa di aspirazione. Caricare punte da 1070 μL e aspirare 600 μL di tampone A (100 % di acqua in acido formico allo 0,1 %) e erogare alle file 1 e 2 di lamiera SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione.NOTA: Se il volume del buffer non si riduce significativamente provare ad aumentare la pressione o il tempo. Caricare 2 file di punte da 1070 μL, aspirare 534 μL di campioni digeriti e erogare alle file 1 e 2 di lamiera SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione. Ripetere questo passaggio fino al caricamento di tutti i campioni.NOTA: Poiché il volume totale dopo l’aggiunta di acido formico sarà di 1068 μL e i campioni sono stati aggiunti in due passaggi. Caricare 2 file di punte da 1070 μL usate, aspirare 600 μL di tampone A e erogare alle file 1 e 2 della piastra SPE. Posizionare la piastra SPE su PPA e applicare pressione. Ripetere il passaggio precedente una volta per pulire il campione. Caricare 1 fila di punte da 1070 μL, aspirare 600 μL di ACN: Acqua (60:40) e erogare alle file 1 e 2 di piastra SPE. Posizionare la piastra SPE sopra una piastra di raccolta per elutare i peptidi utilizzando PPA e applicare pressione. Ripetere il passaggio precedente per elutare i peptidi nella piastra di raccolta. Asciugare la piastra di raccolta a secco e conservare a -80°C fino a ulteriore lavorazione. 4. Etichettatura della dimetilazione (peptide N-termini) Posizionare i suggerimenti richiesti (1070, 90 e 230 μL) e il labware nelle posizioni desiderate nel software. Una volta che tutti i labware e le punte sono a posto, controlla con il layout del mazzo finale e fai clic su Avanti per continuare il protocollo. Per la piastra reagente 2, aggiungere 450 μL di acido acetico 1%, formaldeide leggera da 50 μL (CH2O), 50 μL di formaldeide pesante (13CD2O) e 150 μL di acido formico rispettivamente alle file 1, 2, 3 e 4. Per la piastra reagente 3 aggiungere 50 μL di CB leggero, 50 μL di CB pesante, alle file 1 e 2 e 50 μL di ammoniaca alle file 3 e 4. Caricare 2 file di punte da 230 μL e aspirare 100 μL di acido acetico all’1% dalla riga 1 della piastra di reagente 2 ed erogare ai peptidi essiccati nella piastra campione 2 (piastra di raccolta dalla fase di dissallamento) le file 1 e 2 ed eseguire uno scuotimento a tempo per 5 minuti a 1800 giri/min. Caricare 90 μL di punte e aspirare 16 μL di 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) dalla riga 2 della piastra di reagente 2 e erogare alla riga 1 della piastra del campione. Scaricare i suggerimenti. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 16 μL di 60 mM (4%) 13 la commissione per i CD2O (20% wt/v) dalla riga 3 della piastra di reagente 2 e erogare alla riga 2 della piastra campione. Scaricare i suggerimenti.NOTA: In questo studio la riga 1 corrisponde alla luce e la riga 2 corrisponde a campioni dimetilati pesanti (cfr. figura 1). Caricare 2 file di punte da 90 μL e aspirare 16 μL di 24 mM NaBH3CN e 24 mM NaBD3CN dalla riga 1 e 2 della piastra di reagente 3 e erogare alle righe 1 e 2, rispettivamente della piastra del campione. Scaricare le punte ed eseguire una scossa a tempo per 15 minuti a 1800 giri/min utilizzando lo shaker orbitale.NOTA: L’aggiunta di cianoboroidro di sodio avvia la reazione quindi a ridurre la variabilità tra gli esperimenti questo passaggio viene eseguito una volta per lotto. Caricare 2 file di punte da 90 μL e aspirare 32 μL di ammoniaca all’1% (~28-30% v/v) dalle file 3 e 4 della piastra di reagente 3 e erogare rispettivamente alle file 1 e 2 della piastra campione 2. Scaricare i suggerimenti.NOTA: L’aggiunta di ammoniaca interrompe la reazione, quindi per ridurre la variabilità tra gli esperimenti questo passaggio viene eseguito una volta per lotto. Combina volumi uguali di peptidi dimetilati leggeri e pesanti (1:1) a una nuova piastra di pozzo profondo 2 mL per la dissalazione.NOTA: In questo studio 90 μL del contenuto del pozzo della riga 1 sono stati combinati con 90 μL di fila 2 dalla piastra campione 2 a una nuova piastra di raccolta da 2 mL (piastra campione 3). Il rapporto di luce: la miscelazione pesante dipende dal protocollo sperimentale, in questo studio è stato utilizzato un rapporto 1:1. Caricare 2 file di punte da 230 μL e aspirare 32 μL di acido formico al 5% sui campioni combinati ed eseguire uno scuotimento a tempo per 30 s a 1800 giri/min.NOTA: L’efficienza della dimetilazione dipende dal pH della miscela di reazione e qualsiasi cambiamento nel pH tampone si tradurrà in un’etichettatura incompleta del peptide N-termini. L’efficienza della dimetilazione dovrebbe essere superiore al 97% se cercata come modifica dinamica al peptide N-termini. In questo studio l’efficienza di etichettatura dei peptidi leggeri e pesanti era rispettivamente del 99,7% e del 99,5%. 5. Desalting fase 2 Eseguire la desalinizzazione del campione in modo simile al passaggio 1 del desalt per i campioni combinati. Asciugare i campioni nella piastra del campione utilizzando un vac di velocità e conservare a -80 °C fino a un’ulteriore lavorazione. 6. Etichettatura isobarica (residui di Lys) Seguire la configurazione guidata del labware e posizionare le punte richieste (1070, 90 e 230 μL), con buffer appropriati. Una volta che tutti i labware e le punte sono a posto, controlla con il layout del mazzo finale e fai clic su Avanti per continuare il protocollo. Aggiungere 250 μL di bicarbonato di ammonio trietilico da 100 mM (TEAB), 30 μL di idrossilammina (10% w/v) alle file 1 e 2 di piastra reagente 4. Posizionare i tubi TMT sulla piastra profonda da 2 ml come da foglio di calcolo nella tabella 3. Tenere un tubo vuoto da 1,5 ml in un portatubi per mettere in comune i peptidi etichettati. Posizionare la piastra campione essiccata a P9 e la piastra di lavorazione TMT su P14. Per ricostituire i peptidi, caricare punte da 230 μL e aspirare 100 μL di tampone di bicarbonato di trietile ammonio da 100 mM (TEAB) (pH ~8,5) dalla riga 1 alla piastra TEAB e erogare ai peptidi essiccati alla riga 3 della piastra campione 3. Posizionare la piastra sullo shaker orbitale per 30 s a 1800 giri/min.NOTA: Ricostituire 100 μg di peptidi dimetilati ad una concentrazione di 1 μg/μL. Caricare punte da 90 μL e aspirare 10 μL di acetonitrile anidro da H12 della piastra TMT e erogare in ciascuno dei tubi TMT essiccati. Rimuovere i tubi TMT, il vortice e far girare rapidamente i tubi e tornare a deck in una piastra profonda. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 12,5 μL dei peptidi dimetilati combinati e erogare alla riga 1 della piastra di lavorazione TMT. Scaricare i suggerimenti.NOTA: Il rapporto TMT: peptidico è stato mantenuto a 1:8 per questo esperimento. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 10 μL di TMT e erogare alla riga 1 della piastra di lavorazione TMT. Scaricare le punte, eseguire una scossa a tempo per 1 ora a 1800 giri/min. Caricare 1 fila di punte da 90 μL e aspirare 8 μL di idrossilammina (10% w/v) dalla riga 2 alla piastra TEAB e distribuire alla riga 1 della piastra di lavorazione TMT. Scaricare le punte, eseguire uno scuotimento a tempo per 15 minuti a 1800 giri/min. Unire 30,5 μL dei peptidi etichettati TMT dalla piastra di lavorazione TMT al tubo da 1,5 ml. Scaricare i suggerimenti dopo ogni trasferimento. Rimuovere il tubo con i campioni raggruppati e asciugare per evaporare l’acetonitrile. Ricostituire peptidi in 0,2 mL di acqua nello 0,1 % di acido formico e tornare sul ponte.NOTA: Anche l’efficienza di etichettatura dell’etichettatura isobarica è specifica del pH e l’efficienza di etichettatura deve essere superiore al 98% per le istruzioni del produttore. In questo studio l’efficienza di etichettatura TMT dei peptidi leggeri e pesanti terminati con lisina è stata rispettivamente del 99,4% e del 99,5%. 7. Passo di desalinizzazione Eseguire la desalinizzazione del campione simile al desalt 1 per un campione. Asciugare i campioni e conservare in -80 °C fino all’analisi. 8. Cromatografia liquida-Spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e MS3 Ricostituire i peptidi in acqua di grado MS con 0,1% di FA per ottenere una concentrazione di ~1 μg/μL. Filtrare campioni con tubi a microcentrifugo contenenti un filtro da 0,65 μm. Centrifugare peptidi a 12.000 x g per 3 minuti e posizionare il flusso attraverso una fiala autocampatore.NOTA: La concentrazione di peptidi può essere confermata in questa fase, se lo si desidera. I peptidi dovrebbero essere ricostituiti in acqua di grado LC-MS e sottoposti a un test peptidico BCA. In questo studio, il test BCA peptidico non è stato eseguito e tutte le quantità di peptidi erano basate sul test BCA della proteina iniziale. Preparare i buffer di fase mobile come segue: acqua 100% (v/v) con 0,1% FA (A) e 100% ACN con 0,1% FA (B). Iniettare 1 μL di campione su una colonna trappola imballata con 2 cm di materiale C18 (3 μm, 100 Å pore size).NOTA: La pulizia del campione sulla trappola è la seguente: 10 min, 100% A; 2 μL/min utilizzando un sistema di cromatografia liquida 2D. Eseguire il metodo di separazione analitica. Utilizzare una colonna capillare di silice fusa a punta tirata laser da 100 μm i.d. x 26 cm imballata con materiale C18 (2,5 μm, 100 Å). La pendenza è: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min. Eseguire l’acquisizione dei dati per lo spettrometro di massa mentre è in esecuzione il metodo di separazione analitica. Utilizzare i seguenti parametri per la scansione del rilevamento MS: 375-1.500 m/z,risoluzione 120.000, tempo ciclo 3 s (velocità massima), controllo automatico del guadagno (AGC) obiettivo 4.0e5, tempo massimo di iniezione 50 ms. Utilizzare i seguenti parametri per CID-MS/MS con trappola ionica: scansioni DDA (Data Dependent Acquisition) per risultato, larghezza di isolamento 2 m/z, 35% di energia di collisione normalizzata (NCE), 0,25 attivazione q, tempo di attivazione di 10 ms, 1,0e4 AGC, tempo massimo di iniezione di 100 ms. Utilizzare i seguenti parametri per HCD–MS3 SPS 10: intervallo di scansione 100-400 m/z, numero di scansioni dipendenti 10, AGC 5.0e4, tempo massimo di iniezione 118 ms, energia di collisione HCD 55%, finestra di isolamento MS2 2. 9. Analisi dei dati La ricerca ha generato file RAW per l’elenco di proteine e peptidi utilizzando un software di analisi proteica su un database appropriato.NOTA: i file RAW generati in questo studio sono stati cercati su un database Uniprot del mouse. Poiché in un file RAW è presente un’etichettatura leggera e pesante, cercare in ogni file con due flussi di lavoro peptidi dimetilati leggeri e pesanti. Cercare i file RAW sul database Uniprot del mouse (13/07/2019) con sequenza 53035 con i seguenti parametri: scissione della tripina con un massimo di due scollatura persa, peptide con una lunghezza minima di 6 aminoacidi, tolleranza di massa genitore di 15 ppm, 1 tolleranza alla frammentazione Da Modifiche statiche: dimetilazione leggera (+28.031, peptide N-terminale) o dimetilazione pesante (+36.076 Da, peptide N-terminale), carbamidometile (+57.021 Da, C), Modifiche dinamiche: ossidazione (+15.995 Da, M), tag isobarico 11-plex (229.163 Da, K), 1% FDR, quantificazione degli ioni reporter con 30 ppm di tolleranza di integrazione di picco, centroide più sicuro per il metodo di integrazione.NOTA: Il picco dimetilato pesante include anche un’altra modifica che è ~7 Da (+35.069 Da, peptide N-terminus) dal picco dimetilato leggero e quindi un altro nodo di ricerca dovrebbe essere incorporato per includere anche questa modifica. Eseguire la quantificazione degli ioni reporter in base all’intensità, alla corrispondenza di massa SPS del 65%, al rapporto medio S/N 10, alla correzione isotopica, alla normalizzazione e al ridimensionamento.NOTA: La normalizzazione e il ridimensionamento possono essere eseguiti in base alla quantità totale di peptidi o a una proteina specifica aggiunta al campione. I campioni qc possono anche essere inclusi nei canali per la normalizzazione tra batch o intra-batch in base a un ridimensionamento di riferimento interno a due code18. Le contaminazioni isotopiche di diversi canali TMT non sono state fornite alla ricerca, si consiglia agli utenti di aggiungere la contaminazione isotopica di diversi ioni reporter.

Representative Results

La figura 2 mostra i dati MS rappresentativi di un peptide identificato in tutti i 22 canali di ioni reporter da un esperimento cPILOT a 22 plex, incluse le repliche del flusso di lavoro. La figura 2 (in alto) raffigura una coppia di picchi doppiamente carica separata da una spaziatura da 4 Da m/z che indica un singolo gruppo dimetile incorporato nel peptide. Le coppie di picco dimetilate leggere e pesanti erano isolate e frammentate indipendentemente per produrre la sequenza del peptide. La sequenza del peptide è G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) e corrisponde alla proteina Betaina-omocisteina S-metiltransferasi. Gli ioni di frammento più intensi per i picchi dimetilati leggeri e pesanti(non mostrati ) sono stati ulteriormente isolati per la frammentazione ms3 e gli ioni reporter(m/z 126-131) sono mostrati nella figura 2 (in basso). Le intensità degli ioni reporter sono direttamente proporzionate all’abbondanza peptidica nel campione. L’abbondanza peptidica dei campioni implica che la capacità di pipettazione della piattaforma robotica è abbastanza uniforme tra i 22 campioni. Nel complesso, questo esperimento cPILOT a 22 plex ha portato a 1326 (1209-luce/1181-pesanti) identificazioni di proteine risultanti da peptidi 3098 (6137-leggeri/5872-pesanti)(tabella 4). La figura 3 mostra il box plot tra l’abbondanza di log10 e le intensità totali degli ioni reporter su tutti i 22 canali che mostrano una minore variabilità inter-bene/intercampione. La valutazione dell’automazione totale è stata effettuata esaminando l’errore nell’abbondanza di ioni reporter in ciascuna proteina nei 22 campioni. La figura 4 mostra che l’elaborazione del campione con la piattaforma robotica ha portato a valori CV molto bassi. In particolare, nei 3098 peptidi identificati, il CV medio nell’abbondanza di ioni reporter era rispettivamente del 12,36 % e del 15,03 % per i peptidi dimetilati leggeri e pesanti. Tra questi peptidi il 2032 di questi peptidi aveva un segnale di ioni reporter al di sopra della soglia minima e sono stati ritenuti quantificabili. Figura 1. Flusso di lavoro sperimentale per elaborare 22 campioni in parallelo con un protocollo cPILOT automatizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Quantificazione dei peptidi su 22 campioni. Esempio di spettri MS (in alto) e MS3 (in basso) del peptide G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) quantificati in esperimenti cPILOT automatizzati a 22 plex per picchi leggeri dimetilati (in basso a sinistra) e pesanti dimetilati (in basso a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Box plot delle intensità totali degli ioni reporter rispetto all’abbondanza log10 di 22 campioni utilizzando lo scopritore di proteoma 2.3. Il file RAW è stato cercato due volte per peptidi leggeri e pesanti, ID proteine separatamente con TMT come modifica dinamica, dimetilazione leggera (+28.031 Da) e pesante (+36.076 e +35.069 Da) dimetilazione al peptide N-termini come modifica statica. Una ricerca combinata con tutte le modifiche di cui sopra è stata eseguita utilizzando Proteome Discover 2.3 per ottenere l’abbondanza log 10 di intensità peptidiche su tutti i canali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4. Trame per violino di co-efficiente della variazione dell’abbondanza peptidica dalle intensità di ioni reporter sommate attraverso i canali 126-131 m / z. Il peptide è stato quantificato con un valore medio CV di 12,36 e 15,03 per peptidi quantificabili leggeri (2373) e pesanti (2533). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1. Illustrazione del cPILOT con un singolo peptide. Mostrando l’etichettatura isotopica di due diversi campioni e l’etichettatura isobarica con TMT126, la miscela risultante è stata iniettata a MS per LC-MS3. Clicca qui per scaricare questo file. Nome variabile Valore Descrizione DesaltSamp1 1065 Volume da utilizzare per la desalt fase 1 DesaltSamp2 392 Volume da utilizzare per la desalt fase 2 DesaltSamp3 100 Volume da utilizzare per la desalt fase 3 Devmode False False taglierà i tempi di incubazione a 30sec- True seguirà i tempi di incubazione nel protocollo. DTTVol 3 Volume di DTT Piastra filtro Targa Piastra utilizzata per la dissalezione FilterPlateVol 600 Volume per la desalinizzazione HAWaterWashes False Numero di lavaggi d’acqua sulla piastra SPE IAMVol 2 Volume di iodoacetamide PeptideTMTVol 12.5 Volume di peptide per l’etichettatura TMT Pressione 100 pressione mbar a PPA TempOffSet 1 Variazione della temperatura TMTVol 10 Volume di tag isobarici da aggiungere TrisVol 800 Volume per diluire il campione prima della digestione TrypsinVol 2 Volume di tripside UsePopTimer Vero True visualizza le opzioni per applicare la pressione sulla piastra, se necessario La tabella 1. Elenco di variabili utilizzate nel protocollo cPILOT automatizzato. DilSource DilWell Dest DestWell DilVolume Origine stock Stockwell Ruota campione ID campione 8M_Urea 1 Campioni A1 90 Stock_Samples A1 10 1 8M_Urea 1 Campioni A2 90 Stock_Samples A1 10 2 8M_Urea 1 Campioni A3 90 Stock_Samples A1 10 3 8M_Urea 1 Campioni A4 90 Stock_Samples A1 10 4 8M_Urea 1 Campioni A5 90 Stock_Samples A1 10 5 8M_Urea 1 Campioni A6 90 Stock_Samples A1 10 6 8M_Urea 1 Campioni A7 90 Stock_Samples A1 10 7 8M_Urea 1 Campioni A8 90 Stock_Samples A1 10 8 8M_Urea 1 Campioni A9 90 Stock_Samples A1 10 9 8M_Urea 1 Campioni A10 A10 90 Stock_Samples A1 10 10 8M_Urea 1 Campioni A11 90 Stock_Samples A1 10 11 8M_Urea 1 Campioni A12 90 Stock_Samples A1 10 12 8M_Urea 1 Campioni B1 90 Stock_Samples A1 10 13 8M_Urea 1 Campioni B2 90 Stock_Samples A1 10 14 8M_Urea 1 Campioni B3 b) La commissione per i 90 Stock_Samples A1 10 15 8M_Urea 1 Campioni B4 b) La commissione per i 90 Stock_Samples A1 10 16 8M_Urea 1 Campioni B5 B5 90 Stock_Samples A1 10 17 8M_Urea 1 Campioni B6 b) La commissione per i 90 Stock_Samples A1 10 18 8M_Urea 1 Campioni B7 b) La commissione per i 90 Stock_Samples A1 10 19 8M_Urea 1 Campioni B8 B8 90 Stock_Samples A1 10 20 8M_Urea 1 Campioni B9 B9 b) la commissione 90 Stock_Samples A1 10 21 8M_Urea 1 Campioni B10 B10 90 Stock_Samples A1 10 22 8M_Urea 1 Campioni B11 B1 90 Stock_Samples A1 10 23 8M_Urea 1 Campioni B12 B12 90 Stock_Samples A1 10 24 La tabella 2. Volume di omogenato di fegato di topo e urea da 8 M. SourceWell SourceWell2 Reporter Ion DestWell1 DestWell2 Volume ID campione A1 C1 126 A1 E1 10 1 A3 C3 127N A2 E2 10 2 A5 C5 127C A3 E3 10 3 A7 C7 128N A4 E4 10 4 A9 C9 128C A5 E5 10 5 A11 C11 129N A6 E6 10 6 B2 D2 129C A7 E7 A 10 7 B4 b) La commissione per i D4 130N A8 E8 10 8 B6 b) La commissione per i D6 130C A9 E9 10 9 B8 B8 D8 131N A10 A10 E10 10 10 B10 B10 D10 131C A11 E11 10 11 La tabella 3. Numero totale di peptidi, proteine e partite spettrali peptidiche (PS). CPILOT automatizzato Leggero Pesante Proteine 1209 1181 Peptidi 6137 5872 Psm 14948 16762 La tabella 4. Barcodifica delle etichette isobariche con i campioni etichettati leggeri e pesanti.

Discussion

cPILOT è una strategia di multiplexing avanzata in grado di analizzare fino a 24 campioni in un singolo esperimento. La capacità di multiplexing dipende dal numero di combinazioni di tagging isotopico e isobarico disponibili. L’introduzione del TMTpro⁷, in grado di contrassegnare 16 campioni in un singolo esperimento, può spingere i limiti di cPILOT a 32-plex. cPILOT è costituito da più passaggi di pipettazione e richiede un’ampia cura e abilità dell’utente per eseguire la preparazione del campione. Anche con un utente esperto, gli errori manuali sono inevitabili, il che invita l’uso di piattaforme robotiche per elaborare campioni nella strategia cPILOT. Poiché cPILOT utilizza l’etichettatura dipendente dal pH dei peptidi, il pH deve essere mantenuto per la luce e il pesante set di campioni dimetilati. Il pH leggermente acido-basico può provocare la dimetilazione dei residui di N-termini e lisina. Un vantaggio di cPILOT è che richiede solo la metà dei tag isobarici poiché il peptide N-termini è occupato con i gruppi dimetil. Ciò offre un maggior numero di campioni da etichettare a metà del costo. La gestione di numeri di campione più grandi richiede che i tempi di esposizione dei reagenti siano simili per il primo e l’ultimo campione di un lotto. Un distributore di pipette in grado di ospitare fino a 32 campioni in parallelo può essere raggiunto al meglio con l’uso di dispositivi robotici di movimentazione dei liquidi.

Per elaborare più campioni tramite cPILOT, il flusso di lavoro manuale è stato modificato per incorporare l’automazione. Il gestore liquido robotico utilizzato in questo studio ha due pod con capacità di pipettazione a 96 canali e a 8 canali, con una pinza per posizionare le piastre nelle 28 posizioni del ponte disponibili. Il gestore del liquido è integrato con un apparato a pressione positiva, uno shaker orbitale e un dispositivo per riscaldare / raffreddare i campioni nella piastra del pozzo 96. L’apparato a pressione positiva aiuta a eseguire scambi tampone nelle piastre SPE durante la pulizia, mentre lo shaker orbitale aiuta a vortice / mescolare i campioni. La piattaforma robotica è stata programmata per aspirare e erogare buffer e campioni a piastre da 96 pozzi, incubare, campioni di vortice e piastre di trasferimento. I liquidi con viscosità diverse, come acetonitrile e acqua, richiedono specifiche considerazioni di pipettazione che possono anche essere programmate nel metodo.

Il flusso di lavoro cPILOT, a partire dalla quantificazione proteica da parte di BCA all’etichettatura dei peptidi con tag isobarici (cioè TMT), è stato eseguito sul sistema di gestione dei liquidi. Il protocollo completo è stato scalato per utilizzare 96 piastre di pozzo profondo che possono contenere 2 mL per pozzo. I tamponi sono stati preparati prima dell’inizio dell’esperimento e aggiunti alla piastra del pozzo 96 in modo da consentire l’elaborazione parallela del campione. Nel presente studio, 22 repliche del flusso di lavoro dell’omogeneato epatico del topo sono state aggiunte alle piastre del pozzo profondo e prese attraverso il protocollo cPILOT. Infine, un singolo campione costituito dai peptidi taggati al fegato di topo equimolare da 22 plex è stato iniettato allo spettrometro di massa. Le intensità degli ioni reporter corrispondenti all’abbondanza di peptidi nei campioni hanno dimostrato che i campioni elaborati con il gestore del liquido hanno CV inferiori rispetto al protocollo manuale(dati non mostrati). La piattaforma robotica ha anche notevolmente migliorato la riproducibilità dell’elaborazione del campione. Riproducibilità e robustezza sono fattori molto importanti durante l’elaborazione di un gran numero di campioni. Gli errori di pipetting possono portare a una completa interpretazione errata dei dati e qui la piattaforma robotica ha fornito una bassa variazione tra campioni. Anche l’utilizzo della piattaforma robotica per cPILOT ha ridotto il tempo necessario per preparare i campioni. Ad esempio, dopo aver sviluppato il metodo automatizzato, è stato necessario 2,5 ore per elaborare 22 campioni rispetto a 7,5 ore per il cPILOT manuale. Sono in corso esperimenti nel nostro laboratorio per valutare ulteriormente i confronti dei flussi di lavoro cPILOT manuali e automatizzati. Sulla base di precedenti rapporti del nostro laboratorio, i CV%s di intensità ioniche di reporter proteico nel cPILOT manuale erano in media del 20% con alcuni outlier che superavano questo valore¹².

cPILOT è una strategia di derivatizzazione chimica a livello peptidico, che può essere utilizzata per qualsiasi tipo di campione come cellule, tessuti e fluidi corporei. cPILOT offre un multiplexing dei campioni migliorato e con l’incorporazione dell’automazione può facilitare il multiplexing del campione ad alta produttività nella proteomica. Questa produttività è necessaria per far progredire ulteriormente la malattia e la comprensione biologica e la scoperta del biomarcatore.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono vanderbilt University Start-up Funds e NIH award (R01GM117191) a RASR.

Materials

0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
2 ml black deep well plate	Analytical Sales and Services, Inc.	59623-23BKGC	Any brand of black 96-well plate is sufficient
2 ml clear deep well plate	VWR	75870-796
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Acetonitrile – MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Agilent 500µL plate	Agilent	203942-100	Reagent plate for adding buffers
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Biomek i7 hybrid	Beckmann		Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å)	Bruker		This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
Centrifuge with plate rotor	Thermo Scientific	69720
Micro 21R Centrifuge	Sorval	5437
Dionex 3000 UHPLC	Thermo Scientific		This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass Spectrometer	Thermo Scientific		This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)	Thermo Fisher Scientific	90061
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific
Reservior plate 200ml	Agilent	204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
Targa 20 mg SPE plates	Nest Group, Inc.	HNS S18V	These are C18 cartridges
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Tris	Biorad	161-0716
Biomek 24-Place Tube Rack Holder	Beckmann	373661
Urea	Biorad	161-0731
Water – MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary

Riferimenti

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Citazione di questo articolo

Arul, A. B., Robinson, R. A. Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (166), e61342, doi:10.3791/61342 (2020).