Summary

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

Published: September 16, 2020
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

Abstract

תאי גזע שלד periosteal (P-SSCs) חיוניים לתחזוקה ותיקון עצם לכל החיים, מה שהופך אותם למוקד אידיאלי לפיתוח טיפולים כדי לשפר את ריפוי שבר.  תאי periosteal במהירות נודדים לפציעה כדי לספק כונדרוציטים חדשים osteoblasts לריפוי שבר. באופן מסורתי, היעילות של ציטוקינים כדי לגרום לנדידת תאים נערכה רק במבחנה על ידי ביצוע transwell או שריטה. עם התקדמות במיקרוסקופיה תוך-וינטלית באמצעות עירור מולטי-פוטונים, לאחרונה התגלה כי 1) P-SSCs מבטאים את הגן הנודד CCR5 ו-2) טיפול בליגנד CCR5 המכונה CCL5 משפר את ריפוי השברים ואת ההעברה של מחשבי P-SSCs בתגובה ל- CCL5. תוצאות אלה נלכדו בזמן אמת. מתואר כאן פרוטוקול כדי לדמיין נדידת P-SSC מן נישה שלד תפר עגל (SSC) נישה כלפי פציעה לאחר טיפול עם CCL5. הפרוטוקול מפרט את בנייתו של ריסון עכבר והר הדמיה, הכנה כירורגית של קלבריה העכבר, אינדוקציה של פגם קלבריה, ורכישת הדמיה לשגות זמן.

Introduction

תיקון שבר הוא תהליך דינמי, רב תאי, השונה מהתפתחות השלד העוברי ושיפוץ. במהלך תהליך זה, אינדוקציה של אותות פגיעה מרקמה פגומה מלווה גיוס מהיר, התפשטות, ובידול לאחר מכן של תאי גזע שלד / אבות, אשר כולם קריטיים ליציבות הכוללת קיבוע של שברים1. בפרט, שלבים מוקדמים של ריפוי שבר דורשים היווצרות קדנציה רכה, המיוחסת בעיקר לתאים תושב periosteal2. כאשר העצמות נפגעות, תת-קבוצה של תאי פריוסטאלי מגיבים במהירות ותורמים לסחוסים מובחנים חדשים ומתווכים אוסטאובלסטים בתוך היבלת3, מה שמסבך את נוכחותה של אוכלוסיית תאי גזע שלד/אבות מובהקת בתוך periosteum. לכן, הזיהוי והאפיון התפקודי של תאי גזע השלד (SSCs) המקומיים פריוסטאום מהווים גישה טיפולית מבטיחה למחלות עצם ניווניות ופגמים בעצמות4.

SSCs נחשבים להתגורר במקומות רקמות מרובים, כולל מח העצם. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6.  אלה pc periosteal (P-SSCs) ניתן לתייג עם סמני שושלת מזנכימלית מוקדמת (כלומר, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, ו Axin2-CreER8) במהלך התפתחות עצם עובר4,7,8,9,10. מגבלה משמעותית של מודלים אלה של מעקב אחר שושלת גנטית אחת היא שיש הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות תאים מסומנות. יתר על כן, הם לא יכולים להבחין SSCs מתויגים מן צאצאיהם ב vivo. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו לאחרונה עכבר כתב כפול (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) כדי לדמיין באופן ברור P-SSCs מ- SSCs מח עצם (BM-SSCs)11. עם דגם זה, נקבע כי P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + αSMA + תיוג כפול, בעוד תאים Mx1 + מובחנים יותר שוכנים במח העצם, משטחים אנדוסטאליים ופריוסטיליים, ועצמות קליפת המוח והטראבולר11,12.

ציטוקינים מרובים וגורמי גדילה ידועים לווסת שיפוץ ותיקון עצם נבדקו עבור שיפור של תיקון שלד פגמים מגזר קריטי1,13. עם זאת, בשל המורכבות התאית של מודלים פגיעה שנוצר באמצעות שיבוש המחסום הפיזי של תא העצם, ההשפעות הישירות של מולקולות אלה על נדידת P-SSC אנדוגני והפעלה במהלך הריפוי אינם ברורים. המאפיינים התפקודיים ודינמיקת הנדידה של SSCs מוערכים לעתים קרובות במבחנה על ידי ביצוע בדיקות טרנסוול או שריטה, בשילוב עם ציטוקינים או גורמי גדילה הידועים כמזינים הגירה באוכלוסיות תאים אחרות. לכן, פרשנות של תוצאות אלה ניסויים במבחנה ליישום במערכות vivo המקבילות שלהם הוא מאתגר. נכון לעכשיו, בהערכת vivo של נדידת גזע שלד / אבות לא נצפתה בדרך כלל בזמן אמת; במקום זאת, הוא נמדד בנקודות זמן קבועות לאחר שבר5,7,14,15,16.

מגבלה של שיטה זו היא שההעברה אינה מוערכת ברמה של תא בודד; במקום זאת, הוא נמדד באמצעות שינויים באוכלוסיות התאים. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי חיים חיים ויצירת עכברי כתבים נוספים, מעקב ויוו אחר תאים בודדים אפשרי כעת. באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויאלית חיה של בעלי חיים, ראינו את הנדידה המובהקת של P-SSCs מנישת התפר קלבריה לפגיעה בעצמות בתוך 24-48 שעות לאחר פגיעה בעכברים Mx1/Tomato/αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 זוהה לאחרונה כמנגנון רגולטורי המשפיע על גיוס והפעלה P-SSCs במהלך התגובה לפציעה מוקדמת. מעניין, לא היה זיהוי של הגירה P-SSC משמעותית בתגובה לפציעה בזמן אמת. עם זאת, טיפול בפציעה עם CCL5 מייצר הגירה חזקה ומובהקת לכיוון של P-SSCs, אשר ניתן ללכוד בזמן אמת. לכן, מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה מפורטת להקלטת נדידת in vivo של P-SSCs בזמן אמת לאחר הטיפול עם CCL5.

Protocol

כל העכברים נשמרו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור לרפואה (IACUC). 1. הכנת עכבר קרוס Mx1-Cre17 ו-Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (טום)18 עכברים (שנרכשו ממעבדת ג’קסון) עם עכברי αSMA-GFP (מסופקים כאן על ידי ד”ר איבו…

Representative Results

אבות השלד הוצעו להיות בעלי פוטנציאל נודד או במחזור הדם20. לאחרונה, Mx1-Cre +Rosa26-עגבניות +α SMA-GFP+ (Mx1/עגבניות/αSMA-GFP) נוצרו עכברים כתב, שבו P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + α SMA + תיוג כפול (איור 2A, B). העברה משמע…

Discussion

במהלך ריפוי העצם, תאי periosteal הם המקור העיקרי של כונדרוציטים מובחנים חדשים אוסטאובלסטים בתוך יבלת פציעה3. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6. הערכת מאפיינים פונקציונליים P-SSC אנדוגני הוא מאתגר מבחינה טכנית. לעתים ק?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחלות העצמות של פרס טקסס, פרס קרן החוק קרוליין וויז, ואת NIAMS של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 ל- D.P.  אנו מודים ל- M.E. Dickinson ות.ג’יי וודאקאן בהדמיה אופטית BCM וליבת מיקרוסקופיה חיונית וליבות הטכנולוגיה המתקדמת BCM במימון NIH (AI036211, CA125123 ו- DK056338).

.

Materials

½” optical post ThorLabs TR2 For imaging mount
1 mL syringe BD 309659
27G needle BD PercisionGlide 305111
29G insulin syringe McKesson 102-SN05C905P
50 mL conicol tube Falcon 352098 For mouse restraint
Adjustable angle plate Renishaw R-PCA-5023-50-20 For imaging mount
Alcohol wipes Coviden 6818
betadine surgical scrub Henry Schen 67618-151-16
Buprenorphine SR-LAB ZooPharm 1mg/mL Sustained Release
Combo III Obtained from staff veterinarian N/A 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine
Coverslip Fisher 12-545-87 24 x 40 premium superslip
Fine tip forcepts FST 11254-20
Ketamine KetaVed 50989-161-06 100 mg/mL
Leica TCS SP8MP with DM6000CFS Leica Microsystems N/A
Matrigel R & D Systems 344500101
Medical tape McKesson 100199 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)
Methocellulose Electron Microscopy Sciences 19560
Microdissection scissors FST 1456-12
Motorized stage Anaheim automation N/A
Needle holder FST 12500-12
Nonabsorbable sutures McKesson S913BX monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle
Opthalmic ointment Rugby 0536-1086-91
RANTES Biolegend 594202 10 µg/50 µL
Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex ThorLabs RA90 For imaging mount
Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew ThorLabs TS25H For imaging mount
Sterile cotton swabs Henry Schen 100-9249
Sterile DPBS (1x) Corning 21-030-CV
Sterile drapes McKessen 25-517
Surgical gloves McKessen 3158VA
Triple antibiotic ointment Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Vacutainer blood collection set BD REF 367298 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing

Riferimenti

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
  3. Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
  4. Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
  5. Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
  6. Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
  7. Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
  8. Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
  9. Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
  10. Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  11. Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
  12. Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
  13. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
  14. Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
  15. Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
  16. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  17. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  18. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  19. Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
  20. Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
  21. Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).
  22. Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).

Play Video

Citazione di questo articolo
Ortinau, L., Lei, K., Jeong, Y., Park, D. Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice. J. Vis. Exp. (163), e61162, doi:10.3791/61162 (2020).

View Video