マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

骨折修復は、胚性骨格の発達やリモデリングとは異なる動的な多細胞プロセスです。この過程で、損傷した組織からの傷害シグナルの誘導は、骨格幹細胞/前駆細胞の迅速な導入、増殖、およびその後の分化が続き、骨折の全体的な安定性および固定化に重要である¹。特に、骨折治癒の初期段階では軟質カルス形成が必要であり、これは主にペリオスチールの居住細胞²に起因する。骨が負傷すると、骨膜細胞のサブセットが急速に反応し、^carus3内の新たに分化した軟骨中間体および骨芽細胞に寄与し、骨膜内に明確な骨格幹細胞/前駆細胞集団の存在を含む。したがって、骨膜内に存在する骨格幹細胞(SSC)の同定および機能的特徴付けは、変性骨疾患および骨欠損に対する有望な治療アプローチを構成する^。

SSCは、骨髄を含む複数の組織の位置に存在すると考えられている。骨髄と同様に、骨形成/軟骨性SSCも骨膜^4,5,6で同定されている。 これらの骨膜SSC(P-SSC)は胎児の骨の発達の間に初期間葉系の系統マーカー(すなわち、Prx1-Cre5、Ctsk-Cre7、およびAxin2-CreER8)で標識することができる4,7,8,9,10。これらの単一の遺伝的系統追跡モデルの重要な制限は、標識された細胞集団内に実質的な不均一性があることである。さらに、ラベル付きSSCと生体内の子孫を区別することはできません。この制限に対処するため、我々は最近、骨髄SSC(BM-SSC)¹¹からP-SSCを明確に可視化するためにデュアルレポーターマウス(Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺)を開発しました。このモデルでは、P-SSCはMx1⁺αSMA⁺デュアルラベリングでマークされ、より分化されたMx1⁺細胞は骨髄、内層および骨層の表面、および皮質および骨柱骨^11,12に存在すると判断されました。

複数のサイトカインおよび成長因子は骨のリフォームおよび修復を調節することが知られており、重要なセグメント欠陥における骨格修復の増強について試験された^1,13。しかし、骨室の物理的障壁の破壊によって生じる傷害モデルの細胞複雑さのために、これらの分子が治癒中の内因性P-SSCの移動および活性化に及ぼす直接的な影響は不明である。SSCの機能的特性および回遊性の動態は、多くの場合、他の細胞集団における移行を誘導することが知られているサイトカインまたは成長因子と組み合わせて、トランスウェルまたはスクラッチアッセイを行うことによってインビトロで評価される。従って、これらのインビトロ実験の結果を、対応するin vivoシステムでの応用に対する解釈は困難である。現在、骨格幹細胞/前駆細胞の移動のインビボ評価は、通常、リアルタイムでは観察されません。むしろ、それは骨折後の固定された時点で測定される^{5、7、14、15、16}。

この方法の制限は、移行が単一セル レベルで評価されないことです。むしろ、細胞集団の変化によって測定される。最近では、生きた動物の生体内顕微鏡検査や追加レポーターマウスの生成が進んでいるため、生体内での個々の細胞の追跡が可能になりました。生きた動物の生体内顕微鏡を用いて、Mx1/Tomato/αSMA-GFPマウスの24~48時間の損傷後のカルバリア縫合糸ニッチから骨損傷へのP-SSCの明確な移行を観察した。

CCL5/CCR5は最近、早期傷害反応の間にP-SSCの採用および活性化に影響を与える規制メカニズムとして同定された。興味深いことに、傷害に対する実質的なP-SSC移行の検出はリアルタイムでなかった。しかし、CCL5による損傷の治療は、リアルタイムでキャプチャできるP-SSCの堅牢で方向性的に異なる移行を生み出します。したがって、このプロトコルの目的は、CCL5での処理後にリアルタイムでP-SSCのin vivo移行を記録するための詳細な方法論を提供することにある。