التصوير في الوقت الحقيقي من الهجرة الناجمة عن CCL5 من الخلايا الجذعية الهيكل العظمي البيريوستال في الفئران

إصلاح الكسور هو دينامية، عملية متعددة الخلايا التي تختلف عن نمو الهيكل العظمي الجنيني وإعادة عرض. خلال هذه العملية ، يتبع تحريض إشارات الإصابة من الأنسجة التالفة التوظيف السريع ، والانتشار ، والتمايز اللاحق للخلايا الجذعية / السلف الهيكلية ، والتي تعتبر كلها حاسمة للاستقرار العام لتثبيت ^{الكسور1}. على وجه الخصوص، المراحل المبكرة من شفاء الكسور تتطلب تشكيل كالوس لينة، والتي تعزى أساسا إلى الخلايا المقيمة في الخلايا الفرجية2. عندما تصاب العظام، تستجيب مجموعة فرعية من الخلايا المحيطة بالخلايا المحيطة بالخلايا بسرعة وتساهم في وسيطات الغضاريف وخلايا العظام المتباينة حديثا داخل ^callus3، مما يعني وجود مجموعة خلايا جذعية/ذرية متميزة داخل المحيط. لذلك، فإن تحديد وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية الهيكل العظمي المقيمين في المحيط (SSCs) تشكل نهجا علاجيا واعدا لأمراض العظام التنكسية وعيوب ^{العظام4}.

ويعتقد أن SSCs يقيمون في مواقع متعددة من الأنسجة، بما في ذلك نخاع العظام. وعلى غرار نخاع العظم، تم أيضا تحديد مركبات الكربون الهيدروفلورية/التشوندروجينية في الحضيض ^4،5،6.  يمكن تسمية هذه SSCs periosteal (P-SSCs) بعلامات النسب المتوسطة المبكرة (أي Prx1-Cre5 و Ctsk-Cre7 و Axin2-CreER8) أثناء نمو عظم الجنين ^{4،7،8،9،10}. وهناك قيد كبير على هذه النماذج تتبع النسب الوراثي واحد هو أن هناك تغاير كبير داخل مجموعات الخلايا المسمى. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تستطيع التمييز بين الشركات الخاصة السمية وذرتها في الجسم الحي. لمعالجة هذا القيد، قمنا مؤخرا بتطوير ماوس مراسل مزدوج (Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺) لتصور P-SSCs بوضوح من نخاع العظم SSCs (BM-SSCs)¹¹. مع هذا النموذج، فقد تقرر أن P-SSCs تتميز Mx1 ⁺ αSMA ⁺ الوسم المزدوج، في حين أن أكثر تمايزا Mx1 ⁺ الخلايا الموجودة في نخاع العظام، والأسطح الداخلية والبريوستية، والعظام القشرية والترابية11^،12.

ومن المعروف أن السيتوكينات المتعددة وعوامل النمو لتنظيم إعادة عرض العظام وإصلاحها، وقد تم اختبارها لتعزيز إصلاح الهيكل العظمي في عيوب الجزء ^{الحرج1,13}. ومع ذلك ، بسبب التعقيد الخلوي لنماذج الإصابات الناتجة عن تعطيل الحاجز المادي لمقصورة العظام ، فإن الآثار المباشرة لهذه الجزيئات على هجرة P-SSC الذاتية والتنشيط أثناء الشفاء غير واضحة. غالبا ما يتم تقييم الخصائص الوظيفية وديناميكيات الهجرة في مراكز دعم البرامج في المختبر من خلال إجراء فحص عبر أو خدش ، بالإضافة إلى السيتوكينات أو عوامل النمو المعروفة بالحث على الهجرة في مجموعات الخلايا الأخرى. وبالتالي، فإن تفسير نتائج هذه التجارب المختبرية لتطبيقها في نظمها الحية المقابلة له أمر صعب. وفي الوقت الراهن، لا يلاحظ عادة في الوقت الحقيقي في التقييم الحي لهجرة الخلايا الجذعية/السلف الهيكلية؛ بدلا من ذلك، يتم قياسه في النقاط الزمنية الثابتة بعد ^{الكسر5،7،14،15،16}.

والقيود المفروضة على هذه الطريقة هي أن الهجرة لا تقيم على مستوى خلية واحدة؛ بل إن الهجرة لا يمكن أن تكون كذلك. بدلا من ذلك، يتم قياسه عن طريق التغيرات في مجموعات الخلايا. بسبب التقدم الأخير في المجهر الحيواني الحي داخل الجسم وتوليد فئران مراسل إضافية ، أصبح تتبع الخلايا الفردية في الجسم الحي ممكنا الآن. باستخدام المجهر الحيواني الحي داخل الفيتية ، لاحظنا الهجرة المتميزة ل P-SSCs من مكان خياطة الجلفاريا إلى إصابة العظام في غضون 24-48 ساعة بعد الإصابة في فئران Mx1/Tomato/αSMA-GFP.

وقد تم مؤخرا تحديد CCL5/CCR5 كآلية تنظيمية تؤثر على التوظيف والتنشيط P-SSCs خلال الاستجابة المبكرة للإصابات. ومن المثير للاهتمام أنه لم يتم الكشف عن هجرة كبيرة من جانب لجنة الطوارئ الخاصة استجابة لإصابة في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فإن علاج الإصابة مع CCL5 ينتج هجرة قوية ومتميزة اتجاهيا ل P-SSCs ، والتي يمكن التقاطها في الوقت الفعلي. ولذلك، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو توفير منهجية مفصلة لتسجيل الهجرة في الجسم الحي من P-SSCs في الوقت الحقيقي بعد العلاج مع CCL5.