Summary

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

Published: September 18, 2019
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Summary

三次元共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、生理学的血管新生を模倣するように設計されている。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、CFFCおよびMSCによって形成され、コラーゲンゲルに埋め込まれる。新しいシステムは血管新生調節器の評価に有効であり、生体内研究により関連性の高い情報を提供する。

Abstract

血管新生の分野での研究は、血管新生が関節リウマチ、眼科症、心血管疾患などの50以上の異なる病理学的状態の特徴であるという認識で、ここ数十年で積極的に成長してきました。、および腫瘍転移。血管新生の薬剤開発の間、生理血管新生プロセスを反映するために適切な細胞型および適切な条件を有するインビトロアッセイシステムを使用することが重要である。主に内皮細胞を用いた体外血管新生アッセイ系の現在の限界を克服するために、3次元(3D)共培養スフェロイド発芽アッセイシステムを開発した。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、内皮コロニー形成細胞(CFFC)および間葉系幹細胞(MSC)の2つの比率によって5対1の比率で産生された。EFc+MSCスフェロイドは、生体内細胞外環境を模倣するためにI型コラーゲンマトリックスに埋め込まれた。リアルタイムの細胞レコーダーを用い、24時間のスフェロイドからの血管新芽の進行を連続的に観察した。血管新生電位は、芽の数を数え、個々のスフェロイドから発生する芽の累積長さを測定することによって定量された。実験群ごとに5つのランダムに選択されたスフェロイドを分析した。比較実験は、EFC+MSCスフェロイドが、EFCのみのスフェロイドと比較して、より大きな芽数と累積芽長を示したことを実証した。FDA承認血管新生阻害剤であるベバシズマブは、新たに開発された共培養スフェロイドアッセイシステムを用いて、抗血管新生薬のスクリーニングの可能性を検証した。ECFCのみのスフェロイドと比較したECFC+MSCスフェロイドのIC50値は、異種移植片腫瘍マウスモデルから得られたベバシズマブの有効血漿濃度に近かった。本研究は、3D ECFC+MSCスフェロイド血管新生アッセイシステムが生理学的血管新生に関連し、動物実験の前に有効な血漿濃度を予測できることを示唆している。

Introduction

世界中で約5億人が、関節リウマチ、眼症、心血管疾患、腫瘍転移1などの血管奇形関連疾患に対する血管新生調節療法の恩恵を受ける見込みです。このように、血管新生を制御する薬剤の開発は、製薬業界において重要な研究領域となっています。創薬プロセスの間に、生体内動物研究は、生理機能および臓器間の全身相互作用に対する薬剤候補の影響を探求する必要がある。しかし、倫理的およびコストの問題は、動物実験2に関する懸念を高めています。したがって、動物実験の前により良い意思決定につながるより正確で予測可能なデータを得るためには、インビトロアッセイシステムの改良が必要です。現在の体外血管新生アッセイは、通常、2次元(2D)培養プレート3に播種された内皮細胞(IC)の増殖、侵入、移行、または管状構造形成を測定する。これらの2D血管新生アッセイは、迅速、シンプル、定量的、費用対効果が高く、血管新生調節薬の発見に大きく貢献しています。ただし、いくつかの問題は改善される必要があります。

このような2Dインビトロアッセイシステムは、生体内生理学的条件下で起こる血管新生の複雑な多段階事象を反映することができず、インビトロアッセイデータと臨床試験結果との間に不一致を引き起こす不正確な結果をもたらす4。2D培養条件はまた、細胞型の変化を誘発する。例えば、2D培養プレートで増殖した後、ICはCD34の発現の減少と細胞応答5、6を支配するいくつかのシグナルによって現れる弱い細胞表現型を持つ。2D培養系血管新生アッセイシステムの限界を克服するために、3次元(3D)スフェロイド血管新生アッセイシステムが開発されました。発芽に続いて、ICによって形成されたスフェロイドからの管状構造形成は、生体内ネオ血管化プロセス7,8に反映される。従って、3Dスフェロイド血管新生アッセイは、潜在的なプロまたは抗血管新生薬をスクリーニングするための有効なアッセイシステムと考えられている。

ほとんどの3Dスフェロイド血管新生アッセイは、主にヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)またはヒト真皮微小血管内皮細胞(HDMEC)のみを使用して、血管新生時のICの細胞応答に焦点を当てています。しかし、血液毛細血管は、2つの細胞タイプで構成されています: ICとペリサイト.適切な血管の完全性と機能のためには、ICとペリサイト間の双方向相互作用を詳述することが重要です。遺伝性脳卒中、糖尿病網膜症、静脈奇形などのいくつかの疾患は、内皮9に対する周辺細胞密度の変化または減少した周辺細胞の付着と関連している。血管細胞はまた、血管新生プロセスの重要な要素として知られています。ペリサイトは、新たに形成された容器構造をICで安定させるために募集されています。この点に関して、単培養スフェロイド血管新生アッセイは、ペリサイト7、10を組み込まない。したがって、ICおよびペリサイトによって形成される共培養スフェロイドは、生理学的血管新生事象をより密接に模倣する貴重なアプローチを提供しうる。

本研究は、ヒト内皮コロニー形成細胞(EFC)と間葉系幹細胞(MSC)を組み合わせて生体内血管新生をより密接に反映する3D共培養スフェロイド血管新生アッセイの開発を目指した。正常血管のインインビトロ表現アセンブリとしての共培養スフェロイド系は、2001年11月にKorffらによって最初に設立された。それらはHUVECとヒト臍動脈平滑筋細胞(HUSMC)を組み合わせ、2つの成熟した血管細胞の共培養が発芽電性を減少させたことを実証した。成熟したIC(HUVEC)は、増殖および分化する能力を徐々に失うことが知られており、これは血管新生応答12,13に悪影響を及ぼす。成熟した血管皮細胞(HUSMC)は、血管内皮増殖因子(VEGF)応答性11の剥奪を通じて内皮細胞の不活性化を引き起こす可能性がある。コルフと私たちの共培養スフェロイド系の主な違いは、使用される細胞タイプです。我々は、2つの血管前駆体であるCFFCとMSCを用いて、適切な血管新生アッセイシステムを確立し、プロまたは抗血管新生剤をスクリーニングおよび調査した。EFC は、PC の前駆体です。ECFCは成熟したIC14と比較して堅牢な増殖能力を備えており、PCの限界を克服できます。CFFCは、多くの出生後病態生理学的条件15、16、17における新しい血管形成に寄与する。MSCは、多能性幹細胞であり、多細胞に分化する能力を有し、それによって血管新生18、19に寄与する。

以前の報告では、CFFCおよびMSCは、インビトロチューブ形成20、生体内ネオ血管化21、22、および虚血組織23、24の改善された再灌流に相乗効果を示した。本研究では、CFFCとMSCを用いて共培養スフェロイドを形成し、生体内3D環境を反映するためにI型コラーゲンゲルに埋め込まれた。コラーゲンは、EC25を取り巻く細胞外マトリックス(ECM)の主要成分と考えられている。ECMは、細胞行動26を調節する上で重要な役割を果たしている。ここで提案されるアッセイプロトコルは、一般的な実験室技術を用いて2日以内に容易かつ迅速に行うことができる。発芽プロセス中に効果的な細胞追跡のために、各細胞タイプは、リアルタイムの細胞レコーダーを使用して蛍光標識および監視することができる。新たに確立された3D共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、潜在的な血管新生変調器を評価するための感度を高め、生体内研究の前に予測可能な情報を提供するように設計されています。

Protocol

ヒトECFCは、以前の報告27で述べたように、ヒト末梢血から単離された。簡単に言えば、単核細胞層をフィコル・パック・プラスを用いて全血から分離し、内皮様コロニーが現れるまで適切な培地で培養した。コロニーを収集し、CD31コーティングされた磁気ビーズを用いてCFFCを単離した。MSCは、ヒト成人骨髄の付着単核細胞(MNC)画分から単離した。研究プロトコルは、Duksung?…

Representative Results

比較実験は、単培養スフェロイド(ECFCのみ)と共培養スフェロイド(EFc+MSC)を用いて、MSFcがEFC媒介血管新生において大きな役割を果たしているかどうかを調べた。各スフェロイドからの発芽形成は、スフェロイドからの血管新芽の進行を捕捉できるリアルタイム細胞レコーダーによって24時間モニタリングされた。血管新生電位は、芽の数を数え、個々のスフェロイドから発生する芽の累積長さ?…

Discussion

本研究では、2つのヒト血管細胞前駆体、EFCおよびMSCによって形成された共培養スフェロイドを利用したインビトロ血管新生アッセイ系の改良を導入する。内皮細胞と膜細胞間の相互作用と組み込みによって達成される。この共培養アッセイシステムは、IC媒介血管新生のみを反映する他のインビトロ血管新生アッセイと比較して、細胞相互作用、発芽、チューブ形成を含む生理学的血管新生?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、食品医薬品安全省の助成金(17172MFDS215)、韓国政府(MSIP)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)助成金(2017R1A2A2B4005463)、基礎科学研究プログラムの支援を受けました。韓国国立研究財団(NRF)は、教育省が出資(2016R1A6A1A03007648)。

Materials

0.05 % Trypsin EDTA (1X) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) Gibco 21600-010 PBS (10X)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) Corning 21-031-CVR PBS (1X)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

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Citazione di questo articolo
Shah, S., Lee, H., Park, Y. H., Jeon, E., Chung, H. K., Lee, E. S., Shim, J. H., Kang, K. Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60032, doi:10.3791/60032 (2019).

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