Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi
Summary
Üç boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Co-kültür sheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, ECFCs ve MSCs oluşur ve kollajen jel gömülü. Yeni sistem anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkilidir ve in vivo çalışmaya daha uygun bilgiler sağlar.
Abstract
Anjiyogenez alanındaki çalışmalar, anjiyogenezin romatoid artrit, okülopati, kardiyovasküler hastalıklar gibi 50’den fazla farklı patolojik hastalığın bir özelliği olduğunun kabulüyle son birkaç on yılda agresif bir şekilde büyümektedir. ve tümör metastazı. Anjiyogenez ilaç gelişimi sırasında, fizyolojik anjiyogenez sürecini yansıtmak için uygun hücre tipleri ve uygun koşullara sahip in vitro dosay sistemleri kullanmak çok önemlidir. Mevcut in vitro anjiyogenez istinat sistemlerinin esas olarak endotel hücreleri kullanılarak sınırlandırılmasını aşmak için 3 boyutlu (3D) eş kültür spheroid filizlenme saji sistemi geliştirdik. Co-kültür spheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, endotel kolonioluşturan hücreler (ECFCs) ve mezenkimal kök hücreler (MsCs) 5-1 oranı ile üretildi. ECFCs +MSCs spheroids in vivo ekstrasellüler ortamı taklit etmek için tip I kollajen matris içine gömülü idi. 24 saat boyunca küresel leşmişlerden anjiyojenik filizlenmenin ilerlemesini sürekli olarak gözlemlemek için gerçek zamanlı hücre kaydedici kullanılmıştır. Anjiyojenik potansiyel, filiz sayısı nın sayılarak ve bireysel küresel lerden üretilen filizlerin kümülatif uzunluğunun ölçülmesiyle ölçüldü. Deney grubu başına rastgele seçilen beş küresel analiz yapıldı. Karşılaştırma deneyleri, ECFCs+MSCs spheroidlerinin ecfcs’e özgü küresel lere göre daha fazla filiz sayısı ve kümülatif filiz uzunluğu gösterdiğini göstermiştir. Bevacizumab, BIR FDA onaylı anjiyogenez inhibitörü, anti-anjiyojenik ilaçlar tarama potansiyelini doğrulamak için yeni geliştirilen co-kültür küresel test sistemi ile test edildi. ECFCs+MSCs sferoidler için IC50 değeri, ecfcs’e özel küresel sferoidlere göre ksenogreft tümör fare modelinden elde edilen bevacizumab’ın etkili plazma konsantrasyonuna daha yakındı. Bu çalışma, 3D ECFCs+MSCs sferoid anjiyogenez tsay sisteminin fizyolojik anjiyogenez ile ilgili olduğunu ve hayvan deneyleri öncesinde etkili bir plazma konsantrasyonunu öngörebildiği düşündürmektedir.
Introduction
Dünya çapında yaklaşık 500 milyon kişinin romatoid artrit, okülopati, kardiyovasküler hastalıklar ve tümör metastazı gibi vasküler malformasyonla ilişkili hastalıklar için anjiyogenez modüle edici tedaviden yararlanmasıbeklenmektedir. Böylece, anjiyogenezi kontrol eden ilaçların gelişimi ilaç endüstrisinde önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. İlaç geliştirme sürecinde, in vivo hayvan çalışması, ilaç adaylarının organlar arasındaki fizyolojik fonksiyonlar ve sistemik etkileşimler üzerindeki etkilerini araştırmak için gereklidir. Ancak, etik ve maliyet sorunları hayvan deneyleri ile ilgili endişeleri artmıştır2. Bu nedenle, hayvan deneyleri öncesinde daha iyi karar verme için daha doğru ve öngörülebilir veri elde etmek için geliştirilmiş in vitro araştırma sistemleri gereklidir. Mevcut in vitro anjiyogenez tahlilleri genellikle iki boyutlu (2D) kültür plakaları3tohumlu endotel hücrelerinin (ECs) çoğalma, invazyon, göç veya tübüler yapı oluşumunu ölçmek . Bu 2D anjiyogenez tahlilleri hızlı, basit, kantitatif ve uygun maliyetlidir ve anjiyogenez modüle edici ilaçların keşfine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Ancak, bazı sorunlar geliştirilmeye devam etmektedir.
Bu tür 2D in vitro tahnit sistemleri in vivo fizyolojik koşullarda meydana gelen anjiyogenezin karmaşık çok aşamalı olaylarını yansıtamaz, bu da in vitro tahssonucu verileri ile klinik deney sonuçları arasında tutarsızlıklara neden olan yanlış sonuçlara yol açar4. 2B kültür koşulları da hücresel fenotiplerin değişimine neden olur. Örneğin, 2B kültür plakalarında çoğalma sonra, ECs CD34 azaltılmış ifade ve hücresel yanıtları yöneten çeşitli sinyaller ile tezahür zayıf bir hücresel fenotip var5,6. 2D kültür tabanlı anjiyogenez test sistemlerinin sınırlamalarını aşmak için üç boyutlu (3D) spheroid anjiyogenez test sistemleri geliştirilmiştir. EC’lerin oluşturduğu küresel yapı oluşumunu takip eden filizlenme, vivo neo-vaskülarizasyon süreçlerini yansıtır7,8. Böylece, 3D spheroid anjiyogenez tsay potansiyel pro- veya anti-anjiyogenez ilaçları tarama için etkili bir kontrol sistemi olarak kabul edilmiştir.
En 3D spheroid anjiyogenez tahlilleri sadece ECs kullanmak, özellikle insan göbek ven endotel hücreleri (HUVECs) veya insan dermal mikrovasküler endotel hücreleri (HDMECs) anjiyogenez sırasında ECs hücresel yanıt odaklanmak için. Ancak, kan kılcal damarları iki hücre tipioluşur: ECs ve perisitler. EC’ler ve perisitler arasındaki çift yönlü etkileşimin ayrıntılı olarak detaylandırılması uygun vasküler bütünlük ve fonksiyon için çok önemlidir. Kalıtsal inme, diyabetik retinopati ve venöz malformasyon gibi çeşitli hastalıklar, değişmiş perisit yoğunluğu veya endotel 9 perisit eki azalmış ileilişkilidir. Perisitler de anjiyojenik sürecin önemli bir unsuru olarak bilinir. Perisitler ECs tarafından yeni oluşan damar yapıları stabilize etmek için işe alınır. Bu bağlamda, mono-kültür sheroid anjiyogenez tsay perisit7dahil değildir,10. Bu nedenle, EC’ler ve perisitler tarafından oluşturulan eş-kültür spheroids daha yakından fizyolojik anjiyojenik olayları taklit değerli bir yaklaşım sağlayabilir.
Bu çalışmada, insan endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFCs) ve mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) bir kombinasyonu ile 3Boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez analizi nin vivo anjiyogenezi daha yakından yansıtması amaçlandı. Normal bir kan damarının in vitro temsil montaj olarak Co-kültür küresel sistem ilk Korff ve ark. tarafından 200111yılında kurulmuştur. Onlar HUVECs ve insan göbek arter düz kas hücreleri (HUSMCs) kombine ve iki olgun vasküler hücrelerin co-kültür filizlenme potansiyelini azalttığını gösterdi. Olgun ECs (HUVECs) giderek çoğalmak ve ayırt etmek için yeteneklerini kaybetmek bilinmektedir, hangi olumsuz onların anjiyogenez yanıtları etkiler12,13. Olgun perivasküler hücreler (HUSMCs) vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) duyarlılık11abrogation yoluyla endotel hücre inaktivasyonuna neden olabilir. Korff’un ve ortak kültür küresel sistemimiz arasındaki temel fark kullanılan hücre tipleridir. Pro-veya anti-anti-anjiogenik ajanları taramak ve araştırmak için uygun bir anjiyogenez testi sistemi kurmak için iki vasküler öncül, ECFC ve MsC uyguladık. ECFC’ler, EC’lerin öncüsütür. ECFC’ler, AC’lerin sınırlamasının üstesinden gelmeyi sağlayan olgun EC14ile karşılaştırıldığında sağlam çoğalma kapasitesine sahiptir. ECFCs birçok doğum sonrası patofizyolojik koşullarda yeni damar oluşumuna katkıda15,16,17. MSC’ler perisitlere ayırma kapasitesine sahip pluripotent kök hücrelerdir, bu nedenle anjiyogenez18,19.
Önceki raporlarda, ECFCs ve MSCs in vitro tüp oluşumu üzerinde sinerjik etkileri gösterdi20, in vivo neo-vaskülarizasyon21,22, ve iskemik dokuların geliştirilmiş reperfüzyon23,24. Bu çalışmada, ECFCs ve MSCs co-kültür spheroids oluşturmak için kullanılan ve in vivo 3D ortamı yansıtmak için tip I kollajen jel gömülü. Kollajen, ECs25’içevreleyen hücre dışı matriks (ECM) önemli bileşenleri nden biri olarak kabul edilir. ECM hücre davranışı26düzenleyen kritik bir rol oynar. Burada önerilen test protokolü, ortak laboratuvar teknikleri kullanılarak iki gün içinde kolayca ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Filizlenme işlemi sırasında etkili hücre takibi için, her hücre türü floresan olarak etiketlenebilir ve gerçek zamanlı hücre kaydedici kullanılarak izlenebilir. Yeni kurulan 3D eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi potansiyel anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde duyarlılığı artırmak ve in vivo çalışma öncesinde öngörülebilir bilgi sağlamak için tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, iki insan vasküler hücre atası, ECFC ve MSC’lerden oluşan eş kültür sploroidlerini kullanan geliştirilmiş bir in vitro anjiyogenez titreşme sistemi ortaya konmuştur. endotel hücreleri ve perisitler arasındaki etkileşim ve birleşme ile gerçekleştirilir. Sadece EC’ler aracılı anjiyogenezi yansıtan diğer in vitro anjiyogenez tahlilleri ile karşılaştırıldığında, bu eş-kültür tahlil sistemi hücresel etkileşim, filizlenme, tüp oluşumu da dahil olmak üzere fizyolojik anjiyog…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Gıda ve İlaç Güvenliği Bakanlığı’ndan (17172MFDS215) bir hibe, Kore hükümeti (MSIP) (2017R1A2B4005463) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı(NRF) hibesi ve Temel Bilim Araştırma Programı ile desteklenmiştir. Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
Riferimenti
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
