Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales
Summary
El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.
Abstract
Estudios en el campo de la angiogénesis han ido creciendo agresivamente en las últimas décadas con el reconocimiento de que la angiogénesis es un sello distintivo de más de 50 condiciones patológicas diferentes, como artritis reumatoide, oculopatía, enfermedades cardiovasculares , y metástasis tumoral. Durante el desarrollo de fármacos de angiogénesis, es crucial utilizar sistemas de ensayo in vitro con tipos celulares adecuados y condiciones adecuadas para reflejar el proceso fisiológico de angiogénesis. Para superar las limitaciones de los sistemas actuales de ensayo de angiogénesis in vitro utilizando principalmente células endoteliales, desarrollamos un sistema de ensayo de brote de esferoides de cocultivo tridimensional (3D). Los esferoides de cocultivo fueron producidos por dos precursores de células vasculares humanas, células formadoras de colonias endoteliales (EFC) y células madre mesenquimales (MSC) con una proporción de 5 a 1. Los esferoides ECFCs+MSCs se incrustaron en la matriz de colágeno de tipo I para imitar el entorno extracelular in vivo. Se utilizó un grabador celular en tiempo real para observar continuamente la progresión de la brotación angiogénica de esferoides durante 24 h. La técnica de etiquetado fluorescente de células vivas también se aplicó para tratar la localización de cada tipo de célula durante la formación de brotes. El potencial angiogénico se cuantificó contando el número de brotes y midiendo la longitud acumulada de los brotes generados a partir de los esferoides individuales. Se analizaron cinco esferoides seleccionados al azar por grupo experimental. Los experimentos de comparación demostraron que los esferoides de eCFCs+MSC mostraron un mayor número de brotes y una longitud de brote acumulativa en comparación con los esferoides solo de eFCCs. Bevacizumab, un inhibidor de la angiogénesis aprobado por la FDA, fue probado con el sistema de ensayo esferoide de cocultivo recientemente desarrollado para verificar su potencial para detectar fármacos antiangiogénicos. El valoric 50 para los esferoides de ECFCs+MSC en comparación con los esferoides solo de eFCC sin lugar a la concentración plasmática efectiva de bevacizumab obtenida del modelo de ratón tumor xenoinjerto. El presente estudio sugiere que el sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea 3D ECFCs+MSCs es relevante para la angiogénesis fisiológica, y puede predecir una concentración plasmática efectiva antes de experimentos con animales.
Introduction
Se espera que aproximadamente 500 millones de personas en todo el mundo se beneficien de la terapia moduladora de la angiogénesis para enfermedades asociadas a la malformación vascular, como la artritis reumatoide, la oculopatía, las enfermedades cardiovasculares y la metástasis tumoral1. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos que controlan la angiogénesis se ha convertido en un importante área de investigación en la industria farmacéutica. Durante el proceso de desarrollo de fármacos, es necesario estudiar en animales in vivo para explorar los efectos de los candidatos a fármacos en las funciones fisiológicas y las interacciones sistémicas entre los órganos. Sin embargo, las cuestiones éticas y de costos han aumentado las preocupaciones con respecto a los experimentos con animales2. Por lo tanto, se necesitan sistemas de ensayo in vitro mejorados para obtener datos más precisos y predecibles que conduzcan a una mejor toma de decisiones antes de los experimentos con animales. Los ensayos actuales de angiogénesis in vitro suelen medir la proliferación, invasión, migración o formación de estructura tubular de células endoteliales (EC) sembradas en placas de cultivo bidimensionales (2D)3. Estos ensayos de angiogénesis 2D son rápidos, simples, cuantitativos y rentables, y han contribuido significativamente al descubrimiento de fármacos moduladores de angiogénesis. Sin embargo, quedan varias cuestiones por mejorar.
Estos sistemas de ensayo in vitro 2D no pueden reflejar eventos complejos de angiogénesis en varios pasos que se producen en condiciones fisiológicas in vivo, lo que conduce a resultados inexactos que causan discrepancias entre los datos de ensayo in vitro y los resultados de los ensayos clínicos4. Las condiciones de cultivo 2D también inducen el cambio de fenotipos celulares. Por ejemplo, después de la proliferación en placas de cultivo 2D, los ECs tienen un fenotipo celular débil como se manifiesta por la expresión reducida de CD34 y varias señales que rigen las respuestas celulares5,6. Para superar las limitaciones de los sistemas de ensayo de angiogénesis basados en cultivos 2D, se han desarrollado sistemas de ensayo de angiogénesis esferoide tridimensionales (3D). La formación de la estructura tubular a partir de esferoides formados por eCs refleja los procesos de neovascularización in vivo7,8. Por lo tanto, el ensayo de angiogénesis esferoide 3D se ha considerado un sistema de ensayo eficaz para la detección de posibles fármacos pro o anti-angiogénesis.
La mayoría de los ensayos de angiogénesis esferoide 3D utilizan únicamente eCs, principalmente células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) o células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMC) para centrarse en la respuesta celular de las EC durante la angiogénesis. Sin embargo, los capilares sanguíneos se componen de dos tipos de células: eCs y pericitas. La elaboración de la interacción bidireccional entre los eCs y los pericitas es fundamental para la correcta integridad y función vascular. Varias enfermedades, como el accidente cerebrovascular hereditario, la retinopatía diabética y la malformación venosa, se asocian con una densidad de pericita alterada o una disminución de la unión pericita al endotelio9. Pericytes también se conocen como un elemento clave del proceso angiogénico. Los pericíticos son reclutados para estabilizar las estructuras de buques recién formados por las CE. En este sentido, el ensayo de angiogénesis esferoide monocultivo no incorpora pericitos7,10. Por lo tanto, los esferoides cocultivoformados por eCs y pericitas pueden proporcionar un enfoque valioso para imitar más estrechamente los eventos angiogénicos fisiológicos.
El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un ensayo de angiogénesis esferoide cocultivo 3D con una combinación de células formadoras de colonias endoteliales humanas (ECFC) y células madre mesenquimales (MSC) para reflejar más de cerca la angiogénesis in vivo. El sistema esferoide de cocultura como un conjunto de representación in vitro de un vaso sanguíneo normal fue establecido por primera vez por Korff et al. en 200111. Combinaron HUVECs y células musculares lisas de la arteria umbilical humana (HMM), y demostraron que el cocultivo de dos células vasculares maduras disminuyó el potencial de brotación. Se sabe que las EC maduras (HUVEC) pierden progresivamente su capacidad de proliferar y diferenciar, lo que afecta negativamente a sus respuestas de angiogénesis12,13. Las células perivasculares maduras (HusMC) pueden causar inactivación de células endoteliales a través de la abrogación de la capacidad de respuesta del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)11. La principal diferencia entre Korff y nuestro sistema de esferoides de cocultura son los tipos de células utilizados. Aplicamos dos precursores vasculares, los FCFC y los MSC, para establecer un sistema de ensayo de angiogénesis adecuado para examinar e investigar agentes pro-o-anti-angiogénicos. Los FCFC son el precursor de las CE. Los FCFC tienen una capacidad de proliferación sólida en comparación con los CEmaduros 14,lo que permite superar la limitación de los CE. Los FCFC contribuyen a la formación de nuevos buques en muchas condiciones fisiopatologías post-natales15,16,17. Los MSC son células madre pluripotentes que tienen la capacidad de diferenciarse en pericitos, contribuyendo así a la angiogénesis18,19.
En informes anteriores, los FCFC y los MSC mostraron efectos sinérgicos en la formación de tubos in vitro20, in vivo neo-vascularización21,22, y mejor reperfusión de tejidos isquémicos23,24. En el presente estudio, los EFCC y los MSC se utilizaron para formar esferoides de cocultura e incrustados en gel de colágeno tipo I para reflejar un entorno 3D in vivo. El colágeno se considera como un componente importante de la matriz extracelular (ECM) que rodea a los CE25. El ECM desempeña un papel crítico en la regulación del comportamiento celular26. El protocolo de ensayo propuesto aquí se puede llevar a cabo fácil y rápidamente en un plazo de dos días utilizando técnicas de laboratorio comunes. Para un seguimiento eficaz de las celdas durante el proceso de brotación, cada tipo de celda se puede etiquetar fluorescentemente y supervisarse mediante una grabadora de celdas en tiempo real. El sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea de cocultivo 3D recientemente establecido está diseñado para aumentar la sensibilidad para evaluar posibles moduladores angiogénicos y proporcionar información predecible antes del estudio in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente estudio introduce un sistema de ensayo de angiogénesis in vitro mejorado utilizando esferoides de cocultivo formados por dos progenitores de células vasculares humanas, EFCC y MSC. interacción e incorporación entre células endoteliales y pericítas. En comparación con otros ensayos de angiogénesis in vitro que reflejan sólo la angiogénesis mediada por los CE, este sistema de ensayo de cocultura es más representativo de la cascada multipaso de angiogénesis fisiológica, incluida la interacción celu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por una subvención (17172MFDS215) del Ministerio de Seguridad Alimentaria y de Drogas, la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de Ciencia Básica a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través del Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de CienciaS Básicas a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del National Research Foundation of Korea(NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
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