Protokollen presenterer omprogrammering av perifere blod mononukleære celler for å indusere nevrale stamceller ved Sendai virus infeksjon, differensiering av iNSCs inn dopaminerg neurons, transplantasjon av DA forløpere til ensidig-lesioned Musemodeller for Parkinsons sykdom, og evaluering av sikkerhet og effekt av iNSC-avledede DA forløpere for PD-behandling.
Parkinsons sykdom (PD) er forårsaket av degenerasjon av dopaminerg (DA) neurons på substantia Nigra Pars compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM). Celle erstatning terapi har store løftet for behandling av PD. nylig induserte nevrale stamceller (iNSCs) har dukket opp som en potensiell kandidat for celle erstatning terapi på grunn av redusert risiko for tumor dannelse og plastisitet å gi opphav til områdespesifikke neurons og glia. iNSCs kan omprogrammeres fra autologous somatiske Cellular kilder, som fibroblaster, perifert blod mononukleære celler (PBMNCs) og forskjellige annet typer av celler. Sammenlignet med andre typer somatiske celler, PBMNCs er en tiltalende Start celle type på grunn av det enkle å få tilgang til og utvide i kultur. Sendai virus (SeV), en RNA ikke-integrerende virus, koding omprogrammering faktorer, inkludert humant OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-myC, har en negativ-Sense, Single-strandet, ikke-segmentert Genova som ikke integreres i vert Genova, men bare replikerer i cytoplasma av infiserte celler, og tilbyr en effektiv og trygg bil for omprogrammering. I denne studien, beskriver vi en protokoll der iNSCs er innhentet av omprogrammering PBMNCs, og differensiert i spesialiserte VM DA neurons av en to-trinns metode. Da prekursorer er transplantert inn ensidig 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mus modeller for å evaluere sikkerhet og effekt for behandling av PD. Denne metoden gir en plattform for å undersøke funksjoner og terapeutiske effekter av pasientspesifikke DA nevrale celler in vitro og in vivo.
Parkinsons sykdom (PD) er en vanlig nevrodegenerative lidelse, forårsaket av degenerasjon av dopaminerg (DA) neurons ved substantia Nigra Pars compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM), med en prevalens på mer enn 1% i befolkning over 60 år 1 den andre , 2. i løpet av det siste tiåret, celle terapi, som tar sikte på enten å erstatte den degenerative eller skadede celler, eller nærende mikromiljøet rundt degenereres neurons, har vist potensial i behandling av PD3. I mellomtiden har omprogrammering teknologi gjort betydelige fremskritt4, som gir en lovende mobil kilde for erstatning terapi. Human indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) og embryonale stamceller (ESCs) har vist seg å være i stand til å differensiere i DA nevrale celler, som kunne overleve, maturate, og forbedre motoriske funksjoner når podet inn rotte og ikke-menneskelige primater PD modeller5 ,6,7,8. iPSCs representerer en milepæl i cellulære omprogrammering teknologier og har et stort potensial i celle transplantasjon; Det er imidlertid fortsatt en bekymring for risikoen for tumor dannelse fra ufullstendig differensiert celler. En alternativ mobil kilde for celle transplantasjon er avstamning-begått voksen stamceller innhentet gjennom direkte omprogrammering, slik som indusert nevrale stamceller (iNSCs), som kan utledes fra den ustabile mellom produkter, omgåelsen pluripotency trinn9,10,11.
Både iPSCs og iNSCs kan være omprogrammeres fra autologous cellulære kilder, for eksempel fibroblaster, perifert blod mononukleære celler (PBMNCs) og ulike andre typer celler12,13,14, og dermed redusere immunogenisitet av transplanterte celler i stor grad. Videre, sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med redusert risiko for tumor dannelse og avstamning-begått plastisitet, bare i stand til å differensiere til neurons og glia11. I den innledende studier, menneskelig eller mus iPSCs og iNSCs ble generert fra fibroblaster innhentet fra huden biopsier, som er en invasiv prosedyre14,15. Med denne respekten, PBMNCs er en tiltalende for rett celle kilde på grunn av mindre invasiv prøvetaking prosessen, og enkelt å få et stort antall celler innen en kort periode med utvidelse tid16. Initial omprogrammering studier ansatt integrerende levering systemer, for eksempel lentiviral eller retroviral vektorer, som er effektiv og enkel å implementere i mange typer celler17; disse leveringssystemene kan imidlertid forårsake mutasjoner og reaktivering av gjenværende transgenes, som utgjør sikkerhetsproblemer for kliniske terapeutiske formål12. Sendai virus (SeV) er en ikke-integrerende RNA virus med en negativ-Sense, Single-strandet Genova som ikke integreres ikke i verten Genova, men bare replikerer i cytoplasma av infiserte celler, og tilbyr en effektiv og trygg bil for omprogrammering18 ,19. Rekombinant SeV vektorer er tilgjengelige som inneholder omprogrammering faktorer, inkludert menneskelige OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-myC i sine åpne Reading rammer. I tillegg kan SeV viral vektorer bli ytterligere forbedret ved å innføre temperaturfølsomme mutasjoner, slik at de kunne bli raskt fjernet når kulturen temperaturen er hevet til 39 ° c20. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å programmere PBMNCs til iNSCs ved hjelp av SeV-systemet.
Mange studier har rapportert avledning av da neurons fra humant ESCs eller iPSCs ved hjelp av ulike metoder6,8,21. Det er imidlertid en mangel på protokoller som beskriver differensiering av DA neurons fra iNSCs i detaljer. I denne protokollen vil vi beskrive den effektive generasjonen av DA neurons fra iNSCs ved hjelp av en to-trinns metode. DA neuronal prekursorer kan bli transplantert inn i striatum av PD mus modeller for sikkerhet og effekt evalueringer. Denne artikkelen vil presentere en detaljert protokoll som dekker ulike stadier fra generering av indusert nevrale stamceller ved Sendai virus, differensiering av iNSCs i DA neurons, etablering av mus PD modeller, til transplantasjon av DA forløpere i striatum av PD-modellene. Ved hjelp av denne protokollen, kan man generere iNSCs fra pasienter og sunne donorer og utlede DA neurons som er trygge, standardizable, skalerbar og homogen for celle transplantasjon formål, eller for modellering PD i en tallerken og etterforskning av mekanismene underliggende sykdomsutbruddet og utviklingen.
Her har vi presentert en protokoll som dekket ulike stadier av iNSC-DA celle terapi for PD-modeller. Kritiske aspekter ved denne protokollen inkluderer: (1) isolering og utvidelse av PBMNCs og omprogrammering av PBMNCs i iNSCs av SeV infeksjon, (2) differensiering av iNSCs til DA neurons, (3) etablering av ensidig 6-OHDA-lesioned PD mus modeller og atferdsmessige vurdering, og (4) celle transplantasjon av DA forløpere og atferdsdata vurdering.
I denne protokollen involverer den første delen …
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: Stem Cell og oversettelse nasjonale nøkkel prosjekt (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation i Kina (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing talenter Foundation (2017000021223TD03), support prosjekt av High-Level lærere i Beijing kommunale universiteter i perioden 13th fem-års plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical system High Level talent Award (2015-3-063), Beijing Municipal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Beijing 100, Thousand, og 10000 talenter Fund (2018A03), Beijing kommunale administrasjon av sykehus klinisk medisin utvikling av spesielle finansierings støtte (ZYLX201706), og Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
24-well plate | Corning | 3337 | |
50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
6-well plate | Corning | 3516 | |
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
Insulin | Roche | 12585014 | |
ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
Laminin | Roche | 11243217001 | |
Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
Sucrose | baiaoshengke | ||
TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
Trypan blue | Gibco | T10282 | |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |