말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화
Summary
이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.
Abstract
파킨슨병(PD)은 복부 메센팔론(VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트카(SNpc)에서 도파민성(DA) 뉴런의 변성에 의해 유발된다. 세포 대체 요법은 PD의 치료에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 최근, 유도 신경 줄기 세포 (iNSCs)는 종양 형성의 감소 위험과 가소성으로 인해 세포 대체 요법의 잠재적 인 후보로 부상했다. 지역별 뉴런및 신경교세포. iNSCs는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs) 및 세포의 각종 그밖 모형과 같은 자가 체세포 근원에서 재프로그래밍될 수 있습니다. 체세포의 다른 유형과 비교하여, PBMCMC는 배양에서 접근하고 확장하기 쉽기 때문에 매력적인 스타터 세포 유형입니다. 센다이 바이러스(SeV)는 RNA 비통합 바이러스로, 인간 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함한 재프로그래밍 인자를 인코딩하여, 통합되지 않는 부정적인 감각, 단일 가닥, 비분별 게놈을 가지고 있습니다. 호스트 게놈, 그러나 감염된 세포의 세포질에서만 복제, 재프로그래밍을 위한 효율적이고 안전한 차량을 제안하. 이 연구에서는, 우리는 iNSC가 PBMNCs를 다시 프로그래밍하여 얻어지고, 2단계 방법에 의해 전문화된 VM DA 뉴런으로 분화되는 프로토콜을 기술한다. 이어서 DA 전구체는 PD의 치료에 대한 안전성 및 효능을 평가하기 위해 일방적으로 6-히록시도파민(6-OHDA) 병변형 PD 마우스 모델로 이식된다. 이 방법은 생체외 및 생체 내에서 환자 특이적 DA 신경 세포의 기능 및 치료 효과를 조사하는 플랫폼을 제공한다.
Introduction
파킨슨 병 (PD)은 복부 메센셀론 (VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트 (SNpc)에서 도파민성 (DA) 뉴런의 퇴화로 인한 일반적인 신경 퇴행성 질환으로, 60 세 이상의 인구에서 1 % 이상의 유병률을 가지고 있습니다. 1개 , 2. 지난 10 년 동안 퇴행성 또는 손상된 세포를 대체하거나 퇴행성 뉴런 주변의 미세 환경을 영양화하기위한 세포치료는 PD 3의 치료에 잠재력을 보여주었습니다. 한편, 리프로그래밍 기술은 대체요법을 위한 유망한 세포 공급원을 제공하는 4. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs) 및 배아 줄기 세포(ESCs)는 쥐및 비인간 영장류 PD 모델로 이식할 때 생존, 교화 및 모터 기능을 개선할 수 있는 DA 신경 세포로 분화할 수 있는 것으로 입증되었습니다5 ,6,7,8. iPSCs는 세포 재프로그래밍 기술의 이정표를 나타내며 세포 이식에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나, 불완전하게 분화된 세포에서 종양 대형의 리스크에 관하여 아직도 우려가 있습니다. 세포 이식을 위한 대체 세포 공급원은 불안정한 중간체에서 파생될 수 있는 유도된 신경 줄기 세포 (iNSCs)와 같은 직접적인 재프로그래밍을 통해 얻은 혈통-커밋된 성인 줄기 세포, 다능성을 우회하는 것입니다 단계9,10,11.
iPSCs와 iNSCs는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMcCs) 및 다양한 다른 유형의 세포12,13,14와같은 자가 세포 공급원에서 다시 프로그래밍 할 수 있으므로 이식 된 세포의 면역 원성은 큰 정도입니다. 더욱이, iPSCs에 비해, iNSCs는 종양 형성 및 계보 커밋된 가소성의 감소된 리스크에 내재되어 있으며, 단지 뉴런과 글리아11로분화할 수 있다. 초기 연구에서, 인간 또는 마우스 iPSCs 및 iNSCs는 피부 생검으로부터 얻은 섬유아세포로부터 생성되었고, 이는 침습적 절차14,15이다. 이와 관련하여, PBMCCS는 덜 침습적 샘플링 과정때문에 매력적인 스타터 셀 소스이며, 확장 시간16의짧은 기간 내에 많은 수의 세포를 얻을 수 있다. 초기 리프로그래밍 연구는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 통합 전달 시스템을 사용했으며, 이는 많은유형의 세포에서 효율적이고 구현하기 쉬운 17; 그러나, 이들 전달 시스템은 잔류 트랜스유전자의 돌연변이 및 재활성화를 유발할 수 있으며, 이는 임상 치료 목적으로 안전성 문제를 제시한다12. 센다이 바이러스(SeV)는 숙주 게놈에 통합되지 않고 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 부정적인 감각의 단일 가닥 게놈을 가진 비통합 RNA 바이러스로, 18을 다시 프로그래밍하기 위한 효율적이고 안전한 차량을 제공합니다. ,19. 재조합 SeV 벡터는 그들의 개방 판독 프레임에서 인간 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함하는 재프로그래밍 인자를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 또한, SeV 바이러스 벡터는 온도에 민감한 돌연변이를 도입함으로써 더욱 개선될 수 있으며, 배양 온도가 20°C로 상승될 때 이를 빠르게 제거할 수 있다. 이 문서에서는 SeV 시스템을 사용하여 PBMC를 iNSC로 다시 프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다.
많은 연구는 다양한 방법을 사용하여 인간 ESCs 또는 iPSCs에서 DA 뉴런의 유도를보고했다6,8,21. 그러나, 세부 사항에 iNSC에서 DA 뉴런의 분화를 설명 하는 프로토콜의 부족. 이 프로토콜에서는 2단계 방법을 사용하여 iNSC에서 DA 뉴런의 효율적인 생성을 설명합니다. DA 뉴런 전구체는 안전성 및 효능 평가를 위해 PD 마우스 모델의 줄무늬로 이식될 수 있다. 본 기사는 센다이 바이러스에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생성, DA 뉴런으로의 iNSC 분화, 마우스 PD 모델 의 확립, DA 전구체의 이식에 이르기까지 다양한 단계를 포괄하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. PD 모델의. 이 프로토콜을 사용하여 환자와 건강한 기증자로부터 iNSC를 생성하고 세포 이식 목적으로 안전하고 표준화 가능하며 확장 가능하며 균질한 DA 뉴런을 도출하거나 접시에서 PD를 모델링하고 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 근본적인 질병 개시 및 발달.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 PD 모형을 위한 iNSC-DA 세포 치료의 다른 단계를 포함하는 프로토콜을 제출했습니다. 이 프로토콜의 중요한 양상은 다음과 같습니다: (1) SEV 감염에 의한 PBMC의 분리 및 확장 및 INCCs로의 재프로그래밍, (2) DA 뉴런에 대한 iNCCs의 분화, (3) 일방적인 6-OHDA 병변 PD 마우스 모델 및 행동 평가, (4) DA 전구체 및 행동 평가의 세포 이식.
이 프로토콜에서 첫 번째 부분은 우?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 줄기세포 및 번역 국가핵심프로젝트(2016YFA0101403), 중국국립자연과학재단(81661130160, 81422014, 81561138004), 베이징시 자연과학재단(5142005), 베이징 인재재단(2017000021223TD03), 제13차 5개년 계획(CIT 및 TCD20180333), 베이징 의료시스템 고급인재상(2015-3-063), 베이징시 립대학 고위교사 지원사업 시 보건위원회 기금(PXM 2018_026283_000002), 베이징 백, 천, 만 인재 기금 (2018A03), 베이징 시 립 행정 특별 기금 지원 (ZYLX201706), 및 로얄 소사이어티-뉴턴 고급 펠로우십 (NA150482).
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
Riferimenti
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