Summary

Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

Published: July 11, 2019
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Summary

Le protocole présente la reprogrammation des cellules mononucléaires périphériques de sang pour induire des cellules souches neurales par l’infection de virus de Sendai, différenciation des iNSCs dans les neurones dopaminergiques, transplantation des précurseurs de DA dans le unilatéralement-lesioned Modèles de souris de la maladie de Parkinson, et évaluation de l’innocuité et de l’efficacité des précurseurs d’AD dérivés de l’iNSC pour le traitement de la MALADIE.

Abstract

La maladie de Parkinson (MP) est causée par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) à la substantia nigra pars compacta (SNpc) dans le mesencephalon ventral (VM). La thérapie de remplacement de cellules est grande promesse pour le traitement de la. Récemment, les cellules souches neurales induites (iNSC) ont émergé en tant que candidat potentiel pour la thérapie de remplacement cellulaire due au risque réduit de formation de tumeur et à la plasticité pour donner lieu à neurones et gliales spécifiques à la région. Les iNSC peuvent être reprogrammés à partir de sources cellulaires somatiques autologues, telles que les fibroblastes, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMNC) et divers autres types de cellules. Comparé à d’autres types de cellules somatiques, les PBMNC sont un type attrayant de cellule de démarrage en raison de la facilité d’accès et d’expansion dans la culture. Le virus Sendai (SeV), un virus non intégrateur à ARN, codant des facteurs de reprogrammation tels que l’OCT3/4humain, LE SOX2, le KLF4 et le c-MYC, a un génome à sens négatif, à brin unique et non segmenté qui ne s’intègre pas dans génome hôte, mais ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées, offrant un véhicule efficace et sûr pour la reprogrammation. Dans cette étude, nous décrivons un protocole dans lequel les iNSCs sont obtenus en reprogrammant des PBMNC, et différenciés en neurones spécialisés de DA de VM par une méthode en deux étapes. Ensuite, les précurseurs d’AD sont transplantés dans des modèles de souris à lésion à 6-hyroxydopamine (6-OHDA) pour évaluer l’innocuité et l’efficacité du traitement de la. Cette méthode fournit une plate-forme pour étudier les fonctions et les effets thérapeutiques des cellules neurales DA spécifiques au patient in vitro et in vivo.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est un trouble neurodégénératif commun, causé par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) à la substantia nigra pars compacta (SNpc) dans le mésencéphalon ventral (VM), avec une prévalence de plus de 1% dans la population de plus de 60 ans 1 Fois , 2. Au cours de la dernière décennie, la thérapie cellulaire, visant à remplacer les cellules dégénératives ou endommagées, ou à nourrir le microenvironnement autour des neurones en dégénérescence, a montré un potentiel dans le traitement de la3. Pendant ce temps, la technologie de reprogrammation a fait des progrès significatifs4, qui fournit une source cellulaire prometteuse pour la thérapie de remplacement. Il a été prouvé que les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) et les cellules souches embryonnaires (ESC) sont capables de se différencier en cellules neurales DA, qui pourraient survivre, maturate et améliorer les fonctions motrices lorsqu’elles sont greffées dans des modèles de MP de primates non humains5 ,6,7,8. iPSCs représentent une étape importante dans les technologies de reprogrammation cellulaire et ont un grand potentiel dans la transplantation cellulaire; cependant, il y a toujours une préoccupation au sujet du risque de formation de tumeur des cellules incomplètement différenciées. Une autre source cellulaire pour la transplantation cellulaire est les cellules souches adultes établies par lignée obtenues par reprogrammation directe, telles que les cellules souches neurales induites (iNSC), qui peuvent être dérivées des intermédiaires instables, en contournant la pluripotence étape9,10,11.

Les iPSC et les iNSC peuvent être reprogrammés à partir de sources cellulaires autologues, telles que les fibroblastes, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMNC) et divers autres types de cellules12,13,14, réduisant ainsi le immunogénicité des cellules transplantées dans une large mesure. En outre, par rapport aux iPSC, les iNSC sont inhérents à un risque réduit de formation tumorale et de plasticité liée à la lignée, seulement capable de se différencier en neurones et en gliales11. Dans les études initiales, les iPSC humains ou de souris et les iNSC ont été générés à partir de fibroblastes obtenus à partir de biopsies de la peau, qui est une procédure invasive14,15. À cet égard, les PBMNC sont une source attrayante de cellules de démarrage en raison du processus d’échantillonnage moins invasif, et de la facilité d’obtenir un grand nombre de cellules dans un court laps de temps d’expansion16. Les premières études de reprogrammation ont utilisé des systèmes d’administration intégratif, tels que des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux, qui sont efficaces et faciles à mettre en œuvre dans de nombreux types de cellules17; cependant, ces systèmes d’administration peuvent causer des mutations et la réactivation des transgènes résiduels, qui présentent des problèmes de sécurité à des fins thérapeutiques cliniques12. Le virus Sendai (SeV) est un virus à ARN non intégratif dont le génome à un seul brin à sens négatif ne s’intègre pas dans le génome de l’hôte, mais qui ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées, offrant un véhicule efficace et sûr pour la reprogrammation18 ,19. Des vecteurs SeV recombinants sont disponibles qui contiennent des facteurs de reprogrammation, y compris l’humain OCT3/4, SOX2, KLF4 et c-MYC dans leurs cadres de lecture ouverts. En outre, les vecteurs viraux SeV peuvent être encore améliorés en introduisant des mutations sensibles à la température, de sorte qu’ils pourraient être rapidement enlevés lorsque la température de la culture est élevée à 39 oC20. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour reprogrammer PBMNCs aux iNSCs utilisant le système de SeV.

De nombreuses études ont rapporté la dérivation des neurones DA à partir d’ESC sais humains ou iPSCs en utilisant diverses méthodes6,8,21. Cependant, il ya une pénurie de protocoles décrivant la différenciation des neurones DA des iNSCs dans les détails. Dans ce protocole, nous décrirarons la génération efficace de neurones DA à partir d’iNSCs en utilisant une méthode en deux étapes. Les précurseurs neuronaux DA peuvent être transplantés dans le striatum des modèles de souris pour des évaluations de l’innocuité et de l’efficacité. Cet article présentera un protocole détaillé qui couvre diverses étapes de la génération de cellules souches neurales induites par le virus Sendai, la différenciation des iNSCs dans les neurones DA, l’établissement de modèles de de souris, à la transplantation des précurseurs de DA dans le striatum des modèles. En utilisant ce protocole, on peut générer des iNSC à partir de patients et de donneurs sains et dériver des neurones DA qui sont sûrs, standardisables, évolutifs et homogènes à des fins de transplantation cellulaire, ou pour la modélisation de la DP dans un plat et l’étude des mécanismes l’évolution et le développement de la maladie sous-jacente.

Protocol

Toutes les procédures doivent suivre les lignes directrices du comité institutionnel d’éthique de la recherche humaine. Le consentement éclairé doit être obtenu auprès de patients ou de volontaires en bonne santé avant la collecte de sang. Ce protocole a été approuvé par le comité d’éthique de la recherche humaine de l’établissement et a été exécuté conformément aux lignes directrices de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux. 1. Collecte, isolement…

Representative Results

Ici, nous rapportons un protocole qui couvre différentes étapes de la thérapie cellulaire iNSC-DA pour traiter les modèles de. Tout d’abord, les PBMNC ont été isolés et élargis, et reprogrammés en iNSCs par infection à SeV. Une représentation schématique des procédures avec l’expansion de PBMNC et l’induction d’iNSC est montrée dans la figure 1. Le jour -14, les PBMNC ont été isolés à l’aide d’un milieu de gradient de densité (Tableaudes matériaux). Avant…

Discussion

Ici nous avons présenté un protocole qui a couvert différentes étapes de la thérapie cellulaire iNSC-DA pour des modèles de. Les aspects critiques de ce protocole comprennent : (1) l’isolement et l’expansion des PBMNC et la reprogrammation des PBMNC en iNSC par infection à SeV, (2) la différenciation des iNSC aux neurones DA, (3) l’établissement de modèles de souris à lésion 6-OHDA unilatérales et comportementaux l’évaluation, et (4) la transplantation cellulaire des précurseurs de DA et l’évaluation comp…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les travaux ont été soutenus par les subventions suivantes : Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 8156138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Projet de soutien des enseignants de haut niveau dans les universités municipales de Beijing dans la période du 13e plan quinquennal (CIT et TCD2018033), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Fonds de la Commission municipale de la santé (PXM 2018-026283-000002), Beijing Cent, Mille et Dix Mille Talents (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706), et le Bourse avancée Royal Society-Newton (NA150482).

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

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Citazione di questo articolo
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

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