Transplantação subcapsular renal do Thymus Embryonic murine 2 '-Deoxyguanosine-Tratado em ratos nus
Summary
Nós fornecemos um método simples e eficiente para transplantar 2 ‘-deoxyguanosine tratou e 18.5 timo na cápsula renal de um rato nu. Este método deve auxiliar no estudo da função de células epiteliais tímicas e da maturação das células T.
Abstract
O timo é um importante órgão imunológico central, que desempenha um papel essencial no desenvolvimento e diferenciação de células T. O transplante de timo é um método importante para investigar a função da célula epitelial tímica e a maturação das células T in vivo. Aqui nós descreveremos os métodos experimentais usados dentro de nosso laboratório para transplantar 2 ‘-deoxyguanosine (para esgotar os linfócitos do doador) timo embrionário tratado na cápsula renal de um rato nu camundongos. Este método é simples e eficiente e não requer habilidades especiais ou dispositivos. Os resultados obtidos através deste método simples mostraram que o Timo transplantado pode eficazmente suportar a produção das pilhas de T do receptor. Adicionalmente, vários pontos-chave no que diz respeito ao protocolo serão ainda mais elucidados.
Introduction
O timo é o órgão imunológico central, dentro dos timócitos Timo passam por seleção positiva e negativa, e tornam-se células T maduras1,2. A seleção anormal positiva ou negativa resulta em imunodeficiência ou patologias auto-imunes,respectivamente3,4. Conseqüentemente, a transplantação do órgão do timo é uma aproximação importante para estudar o processo da seleção das pilhas de T no timo do doador. Este método é particular crucial ao analisar a função epithelial Thymic negociada por mutações genéticas que causam o phenotype letal embrionário quando mutado5.
A fim estudar a maturação de pilhas de T de um receptor no timo transplantado, a prostração de linfócitos do doador dentro do timo é necessária. Para este fim, o Timo embrionário de 14, 15 ou 16 dias (E14, E15, E16) é usualmente selecionado6,7. Thymus de estágios mais maduros pode igualmente com sucesso ser esgotado dos linfócitos do doador tratando com 2 ‘-deoxyguanosine. Entretanto, um protocolo detalhado para esgotando linfócitos e o uso da cultura mais velha do Timo não tem sido descrito previamente8,9. Embora os protocolos de transplante tenham sido introduzidos por vários estudos10,11, é necessária uma maior modificação e melhoria desses protocolos.
Nosso protocolo é separado em duas partes: (i) depleção de linfócitos T do estágio de desenvolvimento tardio e 18,5 Timo pela cultura em 2 ‘-deoxyguanosine-contendo meios. (II) transplante do Timo cultivado em receptores. Neste procedimento, nós desenvolvemos uma maneira simples de entregar o grande tecido (E 18.5 Thymus) na cápsula renal com possibilidade reduzida de ferimento de rim. Ao centrar-se no timo mais atrasado da fase, nosso protocolo pode igualmente ser usado diretamente ou com as modificações para a transplantação do timo em vários estágios desenvolventes ou em outros tecidos feitos medida similares.
Protocol
Representative Results
Discussion
A transplantação subcapsular renal do Timo embrionário é um método importante para estudar a função epithelial Thymic das pilhas e o processo da maturação das pilhas de T in vivo. Embora existam vários estudos experimentais sobre cultura e transplante de órgãos do Timo embrionário6,7, nosso protocolo fornece um procedimento alternativo simples na cultura do Timo embrionário murino e subcapsular renal transplantação para o tecido mais velho do timo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo pacote de início da Universidade de Jinan para S.J. e pelo programa de ciência e tecnologia de Guangzhou China (Grant no. 201704020209 a S.J.). Agradecemos a Amy Botta (departamento de biologia, York University, Toronto, ON M3J 1P3, Canadá) para revisão e edição do manuscrito.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
Riferimenti
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
