누드 마우스에서 2'-Deoxyguanosine 처리 된 뮤린 배아 흉골의 신장 탈모 이식
Summary
우리는 2′-데옥시구아노신 처리 된 E18.5 흉선을 누드 마우스의 신장 캡슐로 이식하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 방법은 흉선 상피 세포 기능과 T 세포 성숙 의 연구에서 보좌관해야한다.
Abstract
흉선은 T 세포의 발달 그리고 분화에 있는 필수적인 역할을 하는 중요한 중앙 면역 기관입니다. 흉선 이식은 생체 내에서 흉선 상피 세포 기능 및 T 세포 성숙을 조사하는 중요한 방법입니다. 여기에서 우리는 2′-deoxyguanosine (기증자의 림프구를 고갈하기 위하여) 심질 누드 마우스의 신장 캡슐로 처리된 배아 흉선을 이식하기 위하여 우리의 실험실 에서 이용된 실험적인 방법을 기술할 것입니다. 이 방법은 간단하고 효율적이며 특별한 기술이나 장치가 필요하지 않습니다. 이 간단한 방법을 통해 얻은 결과는 이식된 흉선이 수령인의 T 세포 생산을 효과적으로 지원할 수 있음을 보여주었다. 또한 프로토콜과 관련하여 몇 가지 핵심 사항을 더 자세히 설명합니다.
Introduction
흉선은 중앙 면역 기관이며, 흉선 내 의 흉선 세포는 양성 및 음성 선택을 거치고 성숙한 T 세포1,2가됩니다. 비정상적인 양성 또는 음성 선택은 각각3,4.면역 결핍 또는 자가 면역 병리로 인해 발생합니다. 따라서 흉선 이식은 기증자의 흉선에서 T 세포 선택 과정을 연구하는 중요한 접근법이다. 이 방법은 돌연변이때배아 치명적인 표현형을 일으키는 원인이 되는 유전자 돌연변이에 의해 중재된 흉선 상피 기능을 분석할 때 특히 중요합니다 5.
이식 된 흉선에서 수령인의 T 세포의 성숙을 연구하기 위해서는 흉선 내의 기증자의 림프구가 고갈될 필요가 있습니다. 이를 위해, 배아 14-, 15- 또는 16일(E14, E15, E16) 흉선은 일반적으로6,7을선택한다. 더 성숙한 단계에서 흉선또한 성공적으로 2′-deoxyguanosine로 취급하여 기증자의 림프구의 고갈될 수 있습니다. 그러나, 림프구를 고갈시키고 오래된 흉선 배양을 사용하기 위한 상세한 프로토콜은 이전에8,9에기술되지 않았다. 이식 프로토콜은 여러 연구에 의해 도입된 동안10,11,이러한 프로토콜의 추가 수정 및 개선이 필요하다.
우리의 프로토콜은 두 부분으로 구분된다: (i) 2′-deoxyguanosine 함유 매체에서 배양에 의해 후기 발달 단계 E18.5 흉선에서 T 림프구의 고갈. (ii) 배양된 흉선의 이식. 이 절차에서는, 우리는 신장 상해의 감소된 기회를 가진 신장 캡슐로 큰 조직 (E18.5 흉선)를 전달하는 간단한 쪽을 개발했습니다. 나중 단계 흉선에 집중하는 동안, 우리의 프로토콜은 또한 다양한 발달 단계 또는 그밖 유사한 크기의 조직에서 흉선의 이식을 위한 수정으로 직접 또는 수정으로 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배아 흉골의 신장 탈캡슐 이식은 생체 내에서 흉선 상피 세포 기능 및 T 세포의 성숙 과정을 연구하는 중요한 방법이다. 배아 흉선 장기 배양 및 이식에대한 여러 실험 연구가 있지만 6,7,우리의 프로토콜은 뮤린 배아 흉선 배양 및 신장 subcapsular에 대한 간단한 대체 절차를 제공합니다 이전 흉선 조직에 대한 이식.
우리의 프로토콜은…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 진안대학의 S.J.와 광저우 중국 과학 기술 프로그램(그랜트 번호 201704020209 ~ S.J.)에 의해 지원되었습니다. 우리는 에이미 보타 (생물학과, 요크 대학, 토론토, ON M3J 1P3, 캐나다) 원고의 교정 및 편집에 감사드립니다.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
Riferimenti
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
