Renale Subcapsulaire transplantatie van 2 '-Deoxyguanosine-behandelde Muriene embryonale Thymus in naakt muizen
Summary
Wij bieden een eenvoudige en efficiënte methode voor het transplantatie van 2 ‘-deoxyguanosine behandeld E 18.5 Thymus in de niercapsule van een naakt muis. Deze methode moet worden assistent in de studie van zowel Thymus epitheliale cellen functie en T-cellen rijping.
Abstract
De Thymus is een belangrijk centraal immuun orgaan, dat een essentiële rol speelt in de ontwikkeling en differentiatie van T-cellen. Thymus transplantatie is een belangrijke methode voor het onderzoeken van Thymus epitheliale celfunctie en T-cellen rijping in vivo. Hier zullen we de experimentele methoden beschrijven die in ons laboratorium worden gebruikt om 2 ‘-deoxyguanosine (om lymfocyten van donoren af te putten) behandeld embryonale Thymus in de niercapsule van een athymische naakt muis. Deze methode is zowel eenvoudig als efficiënt en vereist geen speciale vaardigheden of apparaten. De resultaten verkregen via deze eenvoudige methode toonden aan dat getransplanteerde Thymus de productie van de T-cellen van de ontvanger effectief kan ondersteunen. Daarnaast zullen verschillende belangrijke punten met betrekking tot het Protocol verder worden opgehelderd.
Introduction
De Thymus is het centrale immuunsysteem, binnen de thymus thymocyten ondergaan positieve en negatieve selectie, en uitgegroeid tot volwassen T cellen1,2. Abnormale positieve of negatieve selectie resulteert in immunodeficiëntie of auto-immuunpathologieën respectievelijk3,4. Daarom is Thymus-orgaantransplantatie een belangrijke benadering om het proces van de selectie van T-cellen in de Thymus van de donor te bestuderen. Deze methode is met name cruciaal bij het analyseren van de thymische epitheliale functie gemedieerd door genmutaties die embryonaal dodelijk fenotype veroorzaken bij gemuteerde5.
Om de rijping van de T-cellen van een ontvanger in de getransplanteerde Thymus te bestuderen, is uitputting van de lymfocyten van de donor binnen de thymus noodzakelijk. Voor dit doel, embryonale 14-, 15-of 16-daagse (E14, E15, e16) Thymus is meestal geselecteerd6,7. Thymus uit meer volwassen stadia kan ook met succes worden uitgeput van de lymfocyten van de donor door behandeling met 2 ‘-deoxyguanosine. Echter, een gedetailleerd protocol voor het afbreken van lymfocyten en het gebruik van de oudere Thymus cultuur is niet eerder beschreven8,9. Terwijl de transplantatie protocollen zijn geïntroduceerd door verschillende onderzoeken10,11, is verdere wijziging en verbetering van deze protocollen noodzakelijk.
Ons protocol is onderverdeeld in twee delen: (i) depletie van T-lymfocyten uit late ontwikkelingsfase E 18.5 Thymus door cultuur in 2 ‘-deoxyguanosine-bevattende media. (II) transplantatie van de gekweekte Thymus in ontvangers. In deze procedure ontwikkelden we een eenvoudige manier om het grote weefsel (E 18.5 Thymus) in de niercapsule te leveren met een verminderde kans op nierletsel. Terwijl de focus op latere fase Thymus, ons protocol kan ook worden gebruikt direct of met wijzigingen voor transplantatie van Thymus in verschillende ontwikkelingsstadia of andere vergelijkbare grootte weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Renale subcapsulaire transplantatie van embryonale Thymus is een belangrijke methode om de thymus epitheelcellen functie en het proces van T-cellen rijping in vivo te bestuderen. Hoewel er verschillende experimentele studies zijn over de embryonale Thymus-orgel cultuur en transplantatie6,7, biedt ons protocol een eenvoudige alternatieve procedure voor de muriene embryonale Thymus cultuur en renale subcapsulaire transplantatie voor oudere Thymus weefsel.
<p cl…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het Start pakket van Jinan University naar S.J. en door Science and Technology Program van Guangzhou China (Grant No. 201704020209 tot S.J.). We danken Amy Botta (departement biologie, York University, Toronto, op M3J 1P3, Canada) voor het naleden en bewerken van het manuscript.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
Riferimenti
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
