Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici
Summary
Gli effetti trans e multigenerazionali delle sostanze chimiche persistenti sono essenziali per giudicare le loro conseguenze a lungo termine nell’ambiente e sulla salute umana. Forniamo nuovi metodi dettagliati per studiare gli effetti trans e multigenerazionali utilizzando il nematode free-living Caenorhabditis elegans.
Abstract
Le informazioni sulle tossicità delle sostanze chimiche sono essenziali nella loro applicazione e nella gestione dei rifiuti. Per le sostanze chimiche a basse concentrazioni, gli effetti a lungo termine sono molto importanti nel giudicarne le conseguenze nell’ambiente e sulla salute umana. Nel dimostrare influenze a lungo termine, gli effetti delle sostanze chimiche nel corso delle generazioni negli studi recenti forniscono nuove informazioni. Qui, descriviamo protocolli per studiare gli effetti delle sostanze chimiche su più generazioni utilizzando nematode Caenorhabditis elegansfree-living . Sono presentati due aspetti: (1) studi di effetti transgenerazionali (TG) e (2) di effetti multigenerazionali, quest’ultimo dei quali è separato da studi di esposizione multigenerazionale (MGE) e residuio multigenerazionale (MGR). Lo studio sugli effetti TG è robusto con un semplice scopo per determinare se l’esposizione chimica ai genitori può provocare conseguenze residue sulla prole. Dopo che gli effetti sono misurati sui genitori, le soluzioni di ipoclorito di sodio vengono utilizzate per uccidere i genitori e mantenere la prole in modo da facilitare la misurazione degli effetti sulla prole. Lo studio sugli effetti TG viene utilizzato per determinare se la prole è interessata quando il genitore è esposto agli inquinanti. Lo studio degli effetti MGE e MGR viene utilizzato sistematicamente per determinare se l’esposizione generazionale continua può provocare risposte adattative nella prole nel corso delle generazioni. Un attento pick-up e trasferimento sono utilizzati per distinguere le generazioni per facilitare la misurazione degli effetti su ogni generazione. Abbiamo anche combinato protocolli per misurare il comportamento di locomozione, la riproduzione, la durata della vita, i cambiamenti biochimici e dell’espressione genica. Alcuni esperimenti di esempio sono presentati anche per illustrare gli studi sugli effetti trans e multigenerazionali.
Introduction
L’applicazione e la gestione dei rifiuti di sostanze chimiche dipende fortemente dalle informazioni dei loro effetti a determinate concentrazioni. In particolare, il tempo è un altro elemento essenziale tra effetti e concentrazioni. Vale a dire, le sostanze chimiche, soprattutto quelle a basse concentrazioni negli ambienti reali, hanno bisogno di tempo per provocare effetti misurabili1. Pertanto, i ricercatori organizzano diverse lunghezze della durata dell’esposizione negli esperimenti sugli animali e coprono anche l’intero ciclo di vita. Ad esempio, i topi sono stati esposti alla nicotina per 30, 90 o 180 giorni per studiare i suoi effetti tossici 2. Tuttavia, tali durate di esposizione non sono ancora sufficienti a chiarire gli effetti a lungo termine degli inquinanti (ad esempio, inquinanti organici persistenti [POP]) che possono durare su generazioni di organismi nell’ambiente. Pertanto, gli studi sugli effetti nel corso delle generazioni stanno guadagnando sempre più attenzione.
Ci sono due aspetti principali negli studi di effetti generazionali. Il primo è lo studio dell’effetto transgenerazionale (TG) che può verificare in modo robusto se l’esposizione chimica ai genitori può comportare conseguenze sulla prole3. Il secondo è uno studio multigenerazionale degli effetti che è più sistematico con considerazioni sia in esposizione che in quelli residui. Da un lato, gli effetti dell’esposizione multigenerazionale (MGE) vengono utilizzati per illustrare le risposte adattive negli animali agli ambienti difficili a lungo termine. D’altra parte, gli effetti residui multigenerazionali (MGR) sono utilizzati per dimostrare le conseguenze residue a lungo termine dopo l’esposizione, poiché l’esposizione materna è accompagnata da esposizione embrionale alla prima prole e all’esposizione germinale alla seconda prole che rende la terza prole come la prima generazione completamente fuori esposizione4.
Anche se i mammiferi (ad es. topi) sono organismi modello negli studi di tossicità soprattutto in relazione agli esseri umani, la loro applicazione nello studio degli effetti generazionali è piuttosto dispendiosa in termini di tempo, costosa ed eticamente relativa 5 . Di conseguenza, gli organismi tra cui il crostaceo Daphnia magna6, gli insetti Drosophila melanogaster7 e il pesce zebra Danio rerio8, forniscono scelte alternative. Tuttavia, questi organismi o mancano di somiglianze con gli esseri umani, o richiedono attrezzature specifiche negli studi.
Caenorhabditis elegans è un piccolo nematode free-living (circa 1 mm di lunghezza) con un breve ciclo di vita (circa 84 h a 20 gradi centigradi)9. Questo nematode condivide molti percorsi biologici conservatori con gli esseri umani, e quindi è stato ampiamente impiegato per illustrare gli effetti di varie sollecitazioni o tossici10. In particolare, il 99,5% dei nematodi sono ermafroditi che rendono questi organismi estremamente adatti nello studio degli effetti generazionali, ad esempio gli effetti TG di metalli pesanti e solfati33,11, effetti MGE di nanoparticelle d’oro e pesanti metalli12 e temperatura13, effetti MGR della solfonamide14, e gli effetti MGE e MGR di irradiazione gamma15 e lindane4. Inoltre, sono stati riscontrati risultati comparabili tra gli effetti delle sostanze chimiche (ad esempio zearalenone) sullo sviluppo e la riproduzione di topi e C. elegans16,17, che fornirebbero un vantaggio per estrapolare effetti da questo piccolo animale agli esseri umani.
Entrambi gli studi sugli effetti TG e MG richiedono molto tempo e richiedono un’attenta progettazione e prestazioni. In particolare, esistevano differenze nelle scelte della fase di vita, nelle condizioni di esposizione e nei metodi di separazione della generazione negli studi summenzionati. Tali differenze hanno ostacolato il confronto diretto tra i risultati e ostacolato un’ulteriore interpretazione dei risultati. Pertanto, è imperativo stabilire protocolli uniformi per guidare gli studi sugli effetti TG e MG, e anche fornire un quadro più ampio per rivelare modelli simili di vari sostanze tossiche o inquinanti in conseguenze a lungo termine. L’obiettivo superiore dei protocolli attuali dimostrerà chiari processi operativi nello studio degli effetti trans e multigenerazionali con C. elegans. I protocolli andranno a beneficio dei ricercatori interessati a studiare gli effetti a lungo termine di sostanze tossiche o inquinanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al fine di condurre con successo il protocollo descritto, dovrebbero essere presi in considerazione i seguenti suggerimenti. Eseguire le operazioni sperimentali complessive in un ambiente sterile. Un’operazione impropria può provocare la contaminazione dei ceppi di E. coli, ad esempio, funghi e acari può ostacolare la normale crescita di C. elegans e quindi influenzare i risultati sperimentali. Nella sezione che descrive la coltivazione C. elegans, osservare la scala di crescita di C. ele…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
Riferimenti
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