독성물질의 트랜스 및 다세대 효과를 연구하기 위한 예쁜꼬마선충 사용
Summary
지속적인 화학 물질의 트랜스 및 다세대 효과는 환경과 인간의 건강에 대한 장기적인 결과를 판단하는 데 필수적입니다. 우리는 자유로운 살아있는 선충 예쁜 꼬마 예쁜꼬마선충을 사용하여 트랜스 및 다세대 효과를 연구하기위한 새로운 상세한 방법을 제공합니다.
Abstract
화학 물질의 독성에 대한 정보는 응용 및 폐기물 관리에 필수적입니다. 낮은 농도에서 화학 물질에 대 한, 장기적인 효과 환경및 인간의 건강에 그들의 결과 판단에 매우 중요 하다. 장기적인 영향을 입증할 때, 최근 연구에서 여러 세대에 걸친 화학 물질의 영향은 새로운 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 자유로운 살아있는 선충 예쁜꼬마선충을 사용하여 여러 세대에 걸쳐 화학 물질의 효과를 연구하기위한 프로토콜을 설명합니다. 2개의 양상이 제시됩니다: (1) trans-generational (TG) 및 (2) 다세대 효과 연구, 후자는 다세대 노출 (MGE) 및 다세대 잔류 (MGR) 효과 연구로 분리됩니다. TG 효과 연구는 부모에 화학 물질 노출자자식에 어떤 잔여 결과 귀착될 수 있는지 여부를 결정하는 간단한 목적을 가진 강건합니다. 효과에 대한 효과가 부모에 측정 된 후, 나트륨 하이포 염염 용액은 부모를 죽이고 자손을 유지하는 데 사용되어 자손에 대한 효과 측정을 용이하게합니다. TG 효과 연구는 부모가 오염 물질에 노출될 때 자손이 영향을 받는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. MGE 및 MGR 효과 연구는 연속적인 세대 노출이 세대에 걸쳐 자손에 적응 반응을 초래할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 체계적으로 사용됩니다. 각 세대에 대한 효과 측정을 용이하게 하기 위해 세대를 구별하기 위해 신중한 픽업 및 이송이 사용됩니다. 우리는 또한 운동 행동, 재생산, 수명, 생화학 및 유전자 발현 변화를 측정하기 위해 프로토콜을 결합했습니다. 몇 가지 예의 실험은 또한 트랜스-및 다세대 효과 연구를 설명하기 위해 제시된다.
Introduction
화학 물질의 적용 및 폐기물 관리는 특정 농도에서 그 효과의 정보에 크게 의존한다. 특히, 시간은 효과와 농도 사이 또 다른 필수 요소. 즉, 화학 물질, 특히 실제 환경에서 낮은 농도의 화학 물질은 측정 가능한 효과를 유발할 시간이 필요합니다1. 따라서, 연구원은 동물 실험에 있는 노출 기간의 다른 길이를 배열하고, 심지어 전체 수명 주기를 커버합니다. 예를 들어, 마우스는 니코틴에 30, 90 또는 180일 동안 그 독성 효과를 연구하기 위해 2. 그러나, 이러한 노출 기간은 여전히 환경에서 유기체의 세대에 걸쳐 지속 될 수있는 오염 물질 (예를 들어, 지속적인 유기 오염 물질 [POPs])의 장기적인 효과를 해명하기에 충분하지 않습니다. 따라서, 세대에 걸쳐 효과에 대 한 연구 점점 더 많은 관심을 얻고 있다.
세대 간 효과 연구에는 두 가지 주요 측면이 있습니다. 첫 번째는 부모에게 화학 물질 노출이 자손에 어떤 결과를 초래할 수 있는지 여부를 강력하게 테스트 할수있는 트랜스 세대 (TG) 효과 연구입니다 3. 두 번째는 노출 및 잔류 효과 모두에서 고려 사항으로 보다 체계적인 다세대 효과 연구입니다. 한편으로는, 다세대 노출(MGE) 효과는 장기적으로 어려운 환경에 대한 동물의 적응반응을 설명하기 위해 사용된다. 한편, 다세대 잔류(MGR) 효과는 모계 노출이 제1 자손및 생식선 노출에 대한 배아 노출을 수반하기 때문에 노출 후 장기 잔류 결과를 입증하는 데 사용됩니다. 노출 4에서 완전히 1 세대로 세 번째자손을 만드는 자손 .
포유류 (예를 들어, 마우스)는 특히 인간과 관련하여 독성 연구에서 모델 유기체이지만, 세대적 효과를 연구하는 그들의 응용 프로그램은 매우 시간이 많이 걸리고, 비싸고 윤리적으로 관한5. 이에 따라 갑각류 다프니아 마그나6, 곤충 드로소필라 멜라노가스터7 및 제브라피시 다니오 레리오8을포함한 유기체는 대안을 제공한다. 그러나, 이 유기체는 인간과 유사성이 결여되거나, 연구 결과에 있는 특정 장비를 요구합니다.
예쁜꼬마선충은 짧은 수명주기(20°C에서 약 84시간)를 가진 작은 자유생활선충(길이 약 1 mm)이다.9. 이러한 선충은 인간에게 보수적인 많은 생물학적 경로를 공유하며, 따라서 다양한 응력 또는 독성물질(10)의 효과를 설명하기 위해 널리 사용되고 있다. 특히, 선충의 99.5%는 이 유기체가 세대적 효과를 연구하는 데 매우 적합한 헤르마마로디트(hermaphrodites)이며,예를 들어, 중금속과 설폰아미드의 TG 효과 3,11,금 나노입자 및 중성의 MGE 효과 금속12 및 온도13,설폰아미드14의MGR 효과, 감마 조사15 및 린딘4의MGE 및 MGR 효과 모두. 더욱이, 유사 한 결과 화학 물질의 효과 사이 발견 되었다 (예를 들어, zearalenone) 개발 및 쥐와 C. elegans의재생에16,17,추정 하는 이점을 제공할 것 이다 인간에 이 작은 동물에서 효과.
TG 및 MG 효과 연구는 시간이 오래 걸리며 신중한 설계와 성능이 필요합니다. 특히, 앞서 언급한 연구에서 생활 단계 선택, 노출 조건 및 세대 분리 방법에 차이가 존재했습니다. 이러한 차이는 결과 간의 직접적인 비교를 방해하고 결과의 추가 해석을 방해했다. 따라서 TG 및 MG 효과 연구를 안내하는 균일 한 프로토콜을 확립하고 장기적인 결과에서 다양한 독성 물질 또는 오염 물질의 유사한 패턴을 밝히기 위해 더 큰 그림을 제공하는 것이 필수적입니다. 본 프로토콜의 이상 목표는 C. elegans와트랜스 및 다세대 효과를 연구하는 명확한 운영 프로세스를 보여줍니다. 이 프로토콜은 독성물질이나 오염물질의 장기적인 효과를 연구하는 데 관심이 있는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 다음 제안을 고려해야 합니다. 멸균 환경에서 전체 실험 작업을 수행합니다. 부적절한 작동은 대장균 균주의 오염을 초래할 수 있습니다, 예를 들어, 곰팡이와 계귀는 C. 예쁜 꼬마의 정상적인 성장을 방해하고 따라서 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. C. 예쁜꼬마선충을 기르는 것을 설명하는 섹션에서는 육안이나 현미경으로 NG…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
Riferimenti
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