Uso de Caenorhabditis elegans para el estudio de los efectos trans y multigeneracionales de los tóxicos
Summary
Los efectos trans y multigeneracionales de los productos químicos persistentes son esenciales para juzgar sus consecuencias a largo plazo en el medio ambiente y en la salud humana. Proporcionamos métodos detallados novedosos para estudiar los efectos trans y multigeneracionales utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans.
Abstract
La información sobre las toxicidades de los productos químicos es esencial en su aplicación y gestión de residuos. En el caso de los productos químicos a bajas concentraciones, los efectos a largo plazo son muy importantes para juzgar sus consecuencias en el medio ambiente y en la salud humana. Al demostrar influencias a largo plazo, los efectos de los productos químicos a lo largo de generaciones en estudios recientes proporcionan nuevos conocimientos. Aquí, describimos protocolos para el estudio de los efectos de los productos químicos a lo largo de varias generaciones utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans. Se presentan dos aspectos: (1) estudios de efectos transgeneracionales (TG) y (2) multigeneracionales, el segundo de los cuales se separa en estudios de efectos de exposición multigeneracional (MGE) y residual multigeneracional (MGR). El estudio de efecto TG es robusto con un propósito simple de determinar si la exposición química a los padres puede resultar en consecuencias residuales en la descendencia. Después de que los efectos se miden en los padres, las soluciones de hipoclorito de sodio se utilizan para matar a los padres y mantener la descendencia con el fin de facilitar la medición del efecto en la descendencia. El estudio de efecto TG se utiliza para determinar si la descendencia se ve afectada cuando su padre está expuesto a los contaminantes. El estudio de efectos MGE y MGR es sistemático utilizado para determinar si la exposición generacional continua puede dar lugar a respuestas adaptativas en descendencia a lo largo de generaciones. La recogida y la transferencia cuidadosas se utilizan para distinguir las generaciones para facilitar la medición del efecto en cada generación. También combinamos protocolos para medir el comportamiento de la locomoción, la reproducción, la vida útil, los cambios bioquímicos y de expresión génica. También se presentan algunos experimentos de ejemplo para ilustrar los estudios de efectos trans y multigeneracionales.
Introduction
La aplicación y la gestión de residuos de productos químicos depende en gran medida de la información de sus efectos en determinadas concentraciones. En particular, el tiempo es otro elemento esencial entre los efectos y las concentraciones. Es decir, los productos químicos, especialmente aquellos a bajas concentraciones en los entornos reales, necesitan tiempo para provocar efectos mensurables1. Por lo tanto, los investigadores organizan diferentes longitudes de la duración de la exposición en experimentos con animales, e incluso cubren todo el ciclo de vida. Por ejemplo, los ratones estuvieron expuestos a la nicotina durante 30, 90 o 180 días para estudiar sus efectos tóxicos 2. Sin embargo, esas duraciones de exposición todavía no son suficientes para dilucidar los efectos a largo plazo de los contaminantes (por ejemplo, contaminantes orgánicos persistentes [POP]) que pueden durar a lo largo de generaciones de organismos en el medio ambiente. Por lo tanto, los estudios sobre los efectos a lo largo de las generaciones están ganando cada vez más atención.
Hay dos aspectos principales en los estudios de efectos generacionales. El primero es el estudio del efecto transgeneracional (TG) que puede probar con firmez si la exposición química a los padres puede resultar en consecuencias en la descendencia3. El segundo es un estudio de efectos multigeneracional que es más sistemático con consideraciones tanto en la exposición como en los efectos residuales. Por un lado, los efectos de exposición multigeneracional (MGE) se utilizan para ilustrar las respuestas adaptativas en los animales a los entornos desafiantes a largo plazo. Por otro lado, los efectos residuales multigeneracionales (MGR) se utilizan para demostrar las consecuencias residuales a largo plazo después de la exposición, ya que la exposición materna se acompaña de la exposición de embriones a la primera descendencia y la exposición a la línea de gérmenes a la segunda descendencia que hace que la tercera descendencia como la primera generación completamente fuera de la exposición4.
Aunque los mamíferos (por ejemplo, ratones) son organismos modelo en estudios de toxicidad, especialmente en relación con los seres humanos, su aplicación en el estudio de los efectos generacionales es bastante lenta, costosa y éticamente preocupante 5. En consecuencia, organismos como el crustáceo Daphnia magna6, el insecto Drosophila melanogaster7 y el pez cebra Danio rerio8, ofrecen opciones alternativas. Sin embargo, estos organismos carecen de similitudes con los seres humanos o requieren equipos específicos en los estudios.
Caenorhabditis elegans es un pequeño nematodo de vida libre (aproximadamente 1 mm de longitud) con un ciclo de vida corto (aproximadamente 84 h a 20 oC)9. Este nematodo comparte muchas vías biológicas conservadoras para los seres humanos, y por lo tanto se ha empleado ampliamente para ilustrar los efectos de diversas tensiones o tóxicos10. En particular, el 99,5% de los nematodos son hermafroditas por lo que estos organismos son extremadamente adecuados en el estudio de los efectos generacionales, por ejemplo, los efectos TG de metales pesados y sulfonamidos3,11, MGE efectos de nanopartículas de oro y pesadas metales12 y temperatura13, efectos MGR de sulfonamida14, y tanto MGE como MGR efectos de irradiación gamma15 y lindano4. Además, se encontraron resultados comparables entre los efectos de los productos químicos (por ejemplo, zearalenona) en el desarrollo y la reproducción de ratones y C. elegans16,17, lo que proporcionaría una ventaja para extrapolar efectos de este pequeño animal a los seres humanos.
Los estudios de efectos TG y MG consumen mucho tiempo y necesitan un diseño y un rendimiento cuidadosos. En particular, existían diferencias en las opciones en etapa de vida, las condiciones de exposición y los métodos de separación de generación en los estudios antes mencionados. Esas diferencias obstaculizaron la comparación directa entre los resultados y obstaculizaron una interpretación ulterior de los resultados. Por lo tanto, es imperativo establecer protocolos uniformes para guiar los estudios de efectos TG y MG, y también proporcionar un panorama más amplio para revelar patrones similares de diversos tóxicos o contaminantes en consecuencias a largo plazo. El objetivo excesivo de los protocolos actuales demostrará procesos de operación claros en el estudio de los efectos trans y multigeneracionales con C. elegans. Los protocolos beneficiarán a los investigadores interesados en estudiar los efectos a largo plazo de los tóxicos o contaminantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de llevar a cabo con éxito el protocolo descrito, se deben tener en cuenta las siguientes sugerencias. Realizar las operaciones experimentales generales en un entorno estéril. Un funcionamiento inadecuado puede dar lugar a la contaminación de las cepas de E. coli, por ejemplo, hongos y ácaros pueden obstaculizar el crecimiento normal de C. elegans y, por lo tanto, afectar a los resultados experimentales. En la sección que describe el cultivo de C. elegans, observe la escala de c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
Riferimenti
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