Toxicants Trans ve çok jenerasyonel etkileri okumak için Caenorhabditis elegans kullanma
Summary
Sürekli kimyasalların Trans-ve çok jenerasyonel etkileri, çevre ve insan sağlığı üzerinde uzun vadeli sonuçlarını yargılamak için esastır. Ücretsiz yaşam nematod Caenorhabditis eleganskullanarak Trans-ve çok jenerasyonel etkileri incelemek için yeni ayrıntılı Yöntemler sağlıyoruz.
Abstract
Kimyasalların toksisiteleri hakkında bilgi, uygulama ve atık yönetiminde esastır. Düşük konsantrasyonlarda kimyasallar için, uzun vadeli etkileri çok çevre ve insan sağlığı üzerindeki sonuçlarını yargılamak önemlidir. Uzun vadeli etkileri göstererek, kimyasalların son çalışmalarda nesiller boyunca etkileri yeni bir anlayış sağlar. Burada, biz serbest yaşam nematod Caenorhabditis eleganskullanarak birden fazla nesiller üzerinde kimyasalların etkilerini incelemek için protokoller açıklanmaktadır. İki yönü sunulmaktadır: (1) Trans-jenerasyonel (TG) ve (2) çok jenerasyonel etkisi çalışmaları, ikincisi çok jenerasyonel pozlama (MGE) ve çok jenerasyonel kalıntı (MGR) etkisi çalışmalarda ayrılır. TG etkisi çalışma ebeveynler için kimyasal maruz yavru üzerinde herhangi bir kalıntı sonuçları neden olabilir olup olmadığını belirlemek için basit bir amaç ile sağlam. Etkileri ebeveynler üzerinde ölçülen sonra, sodyum hipoklorit çözümleri ebeveynler öldürmek ve yavru üzerinde etki ölçümü kolaylaştırmak için yavru tutmak için kullanılır. TG efekt çalışması, çocuklarının ebeveyn kirleticiler maruz kaldığında etkilenir olup olmadığını belirlemek için kullanılır. MGE ve MGR efekt Etüdü sürekli jenerasyonel pozlama nesiller boyunca yavru uyarlanabilir yanıtlar neden olup olmadığını belirlemek için kullanılan sistematik. Her nesildeki efekt ölçümünü kolaylaştırmak için nesiller ayırt etmek için dikkatli pick-up ve transfer kullanılır. Ayrıca lokomotif davranışlarını, üreme, ömür, biyokimyasal ve gen ifade değişikliklerini ölçmek için protokoller birleştirdik. Bazı örnek deneyler de Trans-ve çok jenerasyonel etkisi etütler göstermek için sunulmaktadır.
Introduction
Kimyasalların uygulama ve atık yönetimi, belirli konsantrasyonlarda etkilerinin bilgilerine son derece bağlıdır. Özellikle, zaman etkileri ve konsantrasyonları arasında başka bir temel unsurdur. Demek ki, kimyasallar, özellikle de gerçek ortamlarda düşük konsantrasyonlarda, ölçülebilir etkileri provoke etmek için zaman gerekir1. Bu nedenle, araştırmacılar hayvan deneylerinde pozlama süresinin farklı uzunlukları düzenlemek ve hatta tüm yaşam döngüsü kapsayacak. Örneğin, fareler nikotin için maruz kaldı 30, 90 veya 180 zehirli etkileri incelemek için gün 2. Ancak, bu tür pozlama süreleri hala kirleticilerin uzun vadeli etkilerini (örneğin, kalıcı organik kirleticiler [POPs]) çevre organizmaların nesiller boyunca sürebilir için yeterli değildir. Bu nedenle, nesiller üzerinde etkileri üzerinde çalışmalar daha fazla ilgi kazanıyor.
Jenerasyonel etki çalışmalarında iki ana yönü vardır. İlki Trans-jenerasyonel (TG) etkisi çalışma, anne-babalar için kimyasal pozlama yavru3herhangi bir sonuca neden olabilir olup olmadığını test edebilirsiniz. İkincisi, hem pozlama hem de kalıntı etkileri ile ilgili hususlar ile daha sistematik olan çok jenerasyonel bir etki çalışmadır. Bir yandan, çok jenerasyonel pozlama (MGE) efektleri, hayvanlarda uzun vadeli zorlu ortamlarda uyarlanabilir tepkiler göstermek için kullanılır. Öte yandan, çok jenerasyonel kalıntı (MGR) etkileri maruz kaldıktan sonra uzun vadeli kalıntı sonuçları göstermek için kullanılır, maternal pozlama ilk yavrularını embriyo maruz kalma ve ikinci germ-Line pozlama ile birlikte olduğundan ilk nesil olarak üçüncü yavrusu tamamen pozlama4yapar yavru.
Memeliler (örn. fareler), özellikle insan varlıklarıyla ilgili olarak toksisite çalışmalarında model organizmalar olmakla birlikte, jenerasyonel etkilere yönelik çalışma uygulamaları oldukça zaman alıcı, pahalı ve etik olarak 5ile ilgili. Buna göre, kabuklu Daphnia magna6, böcek Drosophila melanogaster7 ve zebra balığı Danio rerio8dahil organizmalar, alternatif seçimler sağlar. Ancak, bu organizmaların ya insan, ya da çalışmalar belirli ekipman gerektiren benzerlikleri eksikliği.
Caenorhabditis elegans kısa bir yaşam döngüsü ile küçük bir serbest canlı nematod (yaklaşık 1 mm uzunluğunda) (20 °c ‘ de yaklaşık 84 h)9. Bu nematod insanlar için muhafazakar birçok biyolojik yolları paylaşır, ve bu nedenle yaygın çeşitli stresler veya toksisitan etkileri göstermek için istihdam edilmiştir10. Özellikle,% 99,5 nematitlerin bu organizmalar jenerasyonel etkileri, örneğin, ağır metaller ve sülfonamidler3,11, MGE etkileri TG etkileri eğitim çok uygun hale Hünsa altın Nanopartiküllerin ve ağır metallerin12 ve sıcaklık13, MGR sülfonamid14etkileri, ve Gamma ıŞıNLAMA hem MGE ve MGR etkileri15 ve Lindane4. Ayrıca, kimyasal maddelerin etkileri arasında karşılaştırılabilir sonuçlar bulundu (örneğin, Zearalenone) farelerin geliştirilmesi ve üreme üzerinde ve C. elegans16,17, hangi ayırt etmek için bir avantaj sağlayacak Bu küçük hayvandan insana etkileri.
Hem TG hem de MG efekt çalışmaları zaman alıcı ve dikkatli tasarım ve performansa ihtiyaç vardır. Özellikle, söz konusu çalışmalarda yaşam aşaması seçimleri, pozlama koşulları ve nesil ayırma yöntemlerinde farklılıklar vardı. Bu tür farklılıklar sonuçları arasında doğrudan karşılaştırma engelledi ve sonuçların daha fazla yorumlanması engel. Bu nedenle, TG ve MG etkileri çalışmaları rehberlik etmek için üniforma protokolleri kurmak zorunludur, ve aynı zamanda uzun vadeli sonuçları çeşitli toksisitan veya kirleticiler benzer desenleri ortaya çıkarmak için daha büyük bir resim sağlamak için. Mevcut protokollerin amacı, C. elegansile Trans-ve çok jenerasyonel etkileri araştıran açık çalışma süreçleri gösterecektir. Protokoller, hidrokarbonlar veya kirleticilerin uzun vadeli etkilerini incelemek isteyen araştırmacıların yararına olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokolü başarıyla yürütmek için aşağıdaki öneriler dikkate alınmalıdır. Genel deneysel işlemleri steril bir ortamda gerçekleştirin. Uygunsuz çalışma, E. coli suşlarının kontaminasyonuna neden olabilir, örneğin, mantar ve akarları C. eleganların normal büyümesini engelleyebilir ve bu nedenle deneysel sonuçları etkileyebilir. C. elegans yetiştirmeyi anlatan bölümde, NGM Agarlar üzerindeki c. elegans ‘ın büyüme ölçeğini çıplak gözle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
Riferimenti
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
