Aquí, presentamos un protocolo para la validación in vivo de terapia celular basada en hidrogel, ilustrada por el ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos. Islote de matriz h-Omental (hOMING) implantación de relleno permite la implantación de una mezcla de células-hidrogel entre las capas omentales, cerca de los vasos sanguíneos, para maximizar el engraftment en un ambiente metabólico adecuado.
Medicina regenerativa basada en terapia celular representa una nueva esperanza para curar la enfermedad. Obstáculos actuales incluyen validación correcta en vivo de la eficacia de la terapia. Para la transferencia al cuerpo receptor, las células a menudo necesitan combinarse con biomateriales, especialmente los hidrogeles. Sin embargo, validación de la eficacia de tal injerto requiere el ambiente adecuado, el hidrogel derecha y el sitio derecho destinatario. El epiplón puede ser un sitio tan. Basado en el ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos, desarrollamos la técnica (llenado de matriz islote h-Omental) autoguiados hacia el blanco, que consiste en la inyección del injerto dentro del tejido, entre las capas omentales, para mejorar la supervivencia e implantación de islotes pancreáticos. Para lograr esto, islotes tienen que incluirse en un hidrogel con una viscosidad que permite su inyección con una aguja atraumática. Las jeringas están cargadas de una combinación de hidrogel e islotes. Se realizan varias inyecciones en el tejido omental en puntos de entrada diferentes, y la deposición de la mezcla de islote/hidrogel se hace a lo largo de una línea. Hemos probado la viabilidad de este enfoque innovador con perlas de dextrano. Los granos bien se extienden por todo el tejido omental, en proximidad cercana a los vasos sanguíneos. Para probar la eficacia del injerto, trasplantados islotes en ratas diabéticas y realizar un seguimiento metabólico más de dos meses. Los islotes trasplantados exhiben una alta tasa de re vascularización alrededor y dentro de islotes y revertir la diabetes. La recalada técnica podría ser aplicable a otros tipos de terapia de hidrogel o celular, de células con alta actividad metabólica.
La terapia celular es un tema candente, como pretende curar enfermedades basadas en la medicina regenerativa. Terapias con células madre ayuda de material biológico se han estudiado cada vez más en los últimos años, sobre todo porque a menudo la implantación de la célula requiere un portador para la transferencia de las células de la placa de cultivo para el destinatario. Andamios biomateriales son portadores de células potencialmente valioso que cumplen varias funciones1. Una compañía competente debe proteger las células contra estrés mecánico y proporcionar condiciones favorables de crecimiento, como factores de crecimiento esenciales, excreción de desechos metabólica, el intercambio de sustancias nutrientes y oxígeno2.
Entre los diferentes tipos de biomateriales utilizados en terapia celular, los hidrogeles tienen muchas ventajas. Son biocompatible, biodegradable, fácil de manejar y facilitar la difusión de oxígeno3. Además, la tecnología actual permite el uso de hidrogeles para ayudar a las células sobrevivir y engraft con, por ejemplo, la suplementación con factores de crecimiento o proteínas de matriz extracelular4.
Portadores de hidrogel que contiene las células madre pueden ser inyectados como tratamientos, p. ej., hueso regeneración de enfermedad5 y sistema nervioso6. Es necesaria la implantación de las células metabólicamente activas. Mientras que in vitro validación del enfoque es posible, herramientas y técnicas para la validación en vivo siguen siendo ser refinado.
Trasplante de la célula y del hidrogel puede fácilmente llevarse a cabo por la inyección subcutánea cuando se realizan las pruebas de biocompatibilidad. Sin embargo, cuando las células injertadas se significan para regular factores sistémicos por su acción metabólica, esta localización subcutánea no es óptima, esencialmente en términos de drenaje venoso7. Por lo tanto, no hay ninguna corriente las herramientas de forma rápida, segura y eficaz evaluar los efectos beneficiosos de un hidrogel. El ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos, que exige que sea liberado de las hormonas en el torrente sanguíneo de la prótesis en respuesta a los niveles de glucosa en sangre, hemos desarrollado un nuevo método para la implantación de la célula/hidrogel en vivo.
El primer paso fue identificar un sitio del aceptador del trasplante, que puede aceptar un hidrogel con las células. El epiplón ofrece un gran espacio para la implantación, es muy plástico, y su vascularización densa combinada con el ajuste intraperitoneal es interesante para el estudio de las células con alta actividad metabólica8. A continuación necesitamos establecer una técnica quirúrgica que permite a la transferencia de las células y el hidrogel en el epiplón. Inspirado en el lipofilling utilizado en cirugía plástica9, desarrollamos el islote de matriz h-Omental (hOMING) enfoque de relleno. Islotes encajados hidrogel se inyectan en el tejido omental. La técnica también pretende proporcionar máxima engraftment utilizando múltiples deposiciones de la mezcla de células y el hidrogel en el tejido omental, donde la gran cantidad de vasos sanguíneos también mejora la oxigenación del injerto.
En el presente estudio, describimos una técnica sencilla e innovadora para la implantación de islotes entre hojas omentales, dentro del tejido de grasa más cercana a los vasos sanguíneos. Consiste en cirugía micro-invasiva, que podría ser terminada bajo laparoscopia, con la inyección de islotes dentro de un hidrogel en el tejido adiposo. Esta técnica es fácilmente aplicable a todas las combinaciones de hidrogel y de la célula que deben probarse en un en un ambiente metabólico funcional.
En este protocolo se pueden destacar algunos pasos críticos. En primer lugar, la persona realiza la cirugía y la manipulación de los tejidos debe ser delicada con el tejido adiposo, ya que es frágil. Aplastar o dañar el epiplón debe ser evitado. Epiplón, como un tejido defensivo, se enriquece en los macrófagos y otros leucocitos. Estas células inmunes pueden ser activadas por manipulación excesiva y podrían afectar negativamente el injerto. En segundo lugar, injerto (islote-hidrogel mezcla) de carga también es fundamental. La persona que realiza el procedimiento debe evitar volúmenes muertos y toda la mezcla de hidrogel-islote debe cargar en el dispositivo de inyección. Inmediatamente después de este paso, otro punto crítico es la inyección de sí mismo. La inyección debe realizarse lentamente, con cuidado y con delicadeza. La jeringa debe expulsarse por el hidrogel vacío cargado inicialmente para recuperar cualquier resto islotes. En tercer lugar, la sutura debe realizarse con cuidado y en dos pasos. El plan muscular debe ser suturado en primer lugar, teniendo cuidado de no para suturar el epiplón con el músculo, y la piel debe ser suturada por separado. Con respecto al procedimiento de explantación para el injerto omental, debe tenerse especial atención en el momento cuando las arterias cerca del estómago (arterias gastroepiploica) son incisos. Es importante prestar atención a cualquier hemorragias que se producen y detenerlos antes de suturar el animal, como cualquier persistente sangrado lleva a muerte animal dentro de varios días.
Solución de problemas puede ser necesario en relación con el medio para llevar islotes; la elección de hidrogel es hasta el experimentador, como el hidrogel es inyectable. El uso de diferentes materiales puede resultar en variable del injerto función (con o sin suplementación, por ejemplo). El método descrito aquí ha demostrado su eficacia para co trasplante inertes con un ratio de islote de IEQ 7660/kg.
El presente método puede verse limitado por el tamaño omental y propiedades del hidrogel. Para utilizar un modelo de roedor diabético, tratamiento con insulina es obligatoria antes de la implantación de islotes pancreáticos para proporcionar suficiente área de injerto. Roedores diabéticos pierden mucho peso y masa grasa debido a la diabetes inducida por STZ. Teniendo en cuenta el peso pequeño de los animales inscritos en este estudio, no es posible injertar en una zona más pequeña aún.
Conservación de glicemia adecuada gestión (antes del trasplante utilizando pastillas y después de eso utilizando insulina de acción prolongada) es obligatorio. Aquí, hemos optado por conservar la pelotilla de insulina hasta el día del trasplante por varias razones. En primer lugar, el mantenimiento de un control glucémico adecuado reduce considerablemente el estrés oxidativo inducido por la diabetes en los órganos receptores, que puede ser deletérea para el islote injerto11 y permite la continuación de la terapia intensiva de insulina y receptor preparación en la clínica12. En segundo lugar, hemos querido limitar el número máximo de procedimientos de anestesia para las ratas. En cuanto a la aplicación de la terapia de insulina durante el seguimiento metabólico con insulina de acción prolongada, el esquema utilizado evita complicaciones masivas debido a glucotoxicity (que puede destruir los injertos) y para conservar un valor de glucemia “real”.
Para supervisar la eficacia del injerto, glicemia no es un parámetro relevante en los primeros días si las ratas están recibiendo tratamiento con insulina con pellets. Por esta razón comprobar el nivel de péptido C varias veces previo al trasplante es obligatorio. Estos tiempos son en el inicio del estudio, para seleccionar los animales después de la inyección de STZ y luego justo antes del trasplante, para asegurarse de que las ratas siendo diabéticas y que la regeneración es mínima.
Propiedades del hidrogel también son importantes. Hidrogel líquido goteará fuera tejido omental e hidrogel altamente viscoso no inyectable. Inyectabilidad y viscosidad de hidrogel debe probarse antes de utilizarlo, pero parece esencial también probar el material directamente por la evaluación de islote u otra supervivencia de células in vitro. Aquí, como islotes son muy sensibles a la hipoxia y el uso de un portador muy viscoso puede afectar la difusión de oxígeno.
En cuanto a la importancia del método descrito aquí con respecto a los métodos existentes, esta técnica de trasplante de tejido intra tiene beneficios en términos de reproducibilidad. También es no traumática para el tejido y, por su ubicación extra vascular, evita los riesgos de sangrado y trombosis. También, cuando se considera el trasplante del islote, instantánea reacción inflamatoria mediada por la sangre es evitar14. Además, autoguiado hacia el blanco permite trasplantar islotes en un órgano no vital, a diferencia del trasplante en el hígado, lo que representa un riesgo en términos de función hepática15.
Para producir un rendimiento óptimo, un hidrogel tiene que ser adaptado a las células que va a llevar. Uso de factores de crecimiento o proteínas específicas puede tener un efecto positivo sobre las células trasplantadas16,17.
Para concluir, esta técnica puede utilizarse para la validación in vivo de un hidrogel en diversos tipos celulares, especialmente cuando es necesario un entorno metabólico activo, en cuanto a islotes. Además, esta técnica quirúrgica es aplicable a múltiples aplicaciones y puede ser en el futuro, rápidamente transferible a los humanos, como se puede realizar fácilmente mediante laparoscopia.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por Région Alsacia, BioArtMAtrix-Pôle Alsacia Biovalley-CQDM; 53-14/C1. Los autores agradecemos al equipo de Pr. Bruant-Rodier de Hôpitaux Universitaires de Estrasburgo para ayudar a desarrollar esta técnica innovadora.
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |