نقدم هنا، بروتوكول للتحقق من صحة المجراة في العلاج الخلية على أساس المائية، يتضح من مثال زرع جزيرة ليلى. ح-أومينتال جزيرة مصفوفة ملء غرس (صاروخ موجه) يسمح غرس مزيج الخلية-المائية بين طبقات أومينتال، قرب الأوعية الدموية، إلى أقصى حد ممكن انجرافتمينت في بيئة التمثيل الغذائي سليم.
الطب التجديدي استناداً إلى خلية العلاج يمثل أملا جديداً لعلاج المرض. وتشمل العقبات الحالية السليم في فيفو التحقق من كفاءة العلاج. لنقلها إلى الجهة المستفيدة، الخلايا غالباً ما تحتاج إلى أن تكون جنبا إلى جنب مع المواد الحيوية، لا سيما الهلاميات المائية. مع ذلك، يتطلب التحقق فعالية هذه طعم البيئة الصحيحة والمائية الصحيح والموقع حق المستفيد. قد يكون الثرب مثل هذا موقع. استناداً إلى المثال زرع جزيرة ليلى، قمنا بتطوير التقنية (ملء المصفوفة جزيرة ليلى ح Omental) صاروخ موجه، الذي يتكون من حقن الفساد داخل الأنسجة، ما بين طبقات أومينتال، تحسين غرس جزيرة ليلى والبقاء على قيد الحياة. لتحقيق هذا الهدف، الجزر الصغيرة يجب أن تكون جزءا لا يتجزأ في المائية مع لزوجة التي تمكن من حقن استخدام إبرة أتروماتيك. يتم تحميل المحاقن مع مزيج من المائية والجزر الصغيرة. حقن عدة يتم تنفيذها داخل الأنسجة أومينتال في مختلف نقاط الدخول، وترسب الخليط جزيرة ليلى/المائية على طول خط. نحن اختبار جدوى هذا النهج المبتكرة استخدام الخرز ديكستران. الخرز موزعة بشكل جيد في جميع أنحاء الأنسجة أومينتال، بالقرب من الأوعية الدموية. لاختبار فعالية الاختلاس، ونحن زرع جزيرات في الفئران السكري وإجراء متابعة ايضية أكثر من شهرين. الجزر زرع أظهرت ارتفاع معدل إعادة الأوعية الدموية حول وداخل الجزر الصغيرة، وعكس مرض السكري. تقنية صاروخ موجه يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من العلاج بالخلايا أو المائية، للخلايا ذات النشاط الأيضي عالية.
خلية العلاج موضوع ساخن، كما أنها تهدف إلى علاج الأمراض استناداً إلى الطب التجديدي. قد درسنا العلاجات خلية ساعدت المواد البيولوجية متزايدة في السنوات الأخيرة، خاصة وأن زرع الخلايا غالباً ما يتطلب ناقل لنقل الخلايا من طبق الثقافة إلى المستلم. السقالات مادة بيولوجية هي شركات يحتمل أن تكون قيمة الخلية التي تفي بأدوار عدة1. ينبغي حماية الخلايا من الضغوط الميكانيكية ناقل مختصة وتوفير ظروف النمو المواتية، مثل عوامل أساسية للنمو وإفراز النفايات الأيضية وتبادل المواد الغذائية والأكسجين2.
من بين أنواع مختلفة من المواد الحيوية المستخدمة في العلاج بالخلايا، الهلاميات المائية لها العديد من المزايا. وهم متوافق حيويا، والقابلة للتحلل، وسهلة للتعامل معها، وتيسير نشر الأوكسجين3. وعلاوة على ذلك، يسمح التكنولوجيا الحالية باستخدام الهلاميات المائية لمساعدة الخلايا البقاء على قيد الحياة وانجرافت مع، على سبيل المثال، مكملات مع عوامل النمو أو مصفوفة خارج الخلوية البروتينات4.
يمكن حقن حاملات المائية التي تحتوي على الخلايا الجذعية كعلاج، العظام مثلاً التجديد5 والجهاز العصبي الأمراض6. هناك حاجة إلى زرع خلايا أيضي نشطة. أثناء التحقق من الصحة في المختبر للنهج ممكناً، تظل أدوات وتقنيات للتحقق من صحة المجراة في صقل.
زرع الخلية والمائية يمكن بسهولة يتم عن طريق الحقن تحت الجلد عندما يتم إجراء اختبارات توافق مع الحياة. ومع ذلك، عند الخلايا المطعمة تعنيه إجراءاتها الأيضية لتنظيم العوامل النظمية، هذا التعريب تحت الجلد ليس الأمثل، أساسا من حيث التصريف الوريدي7. ولذلك، توجد أية أدوات الحالية بسرعة وأمان وكفاءة تقييم الآثار المفيدة للمائية. استناداً إلى المثال زرع جزيرة ليلى، الأمر الذي يتطلب أن يتم الإفراج عن هرمونات في مجرى الدم من الفساد استجابة لمستويات السكر في الدم، قمنا بتطوير طريقة جديدة لزرع خلايا/المائية الحية.
الخطوة الأولى هي تحديد موقع زرع يقبلون، التي يمكن أن تقبل المائية مع الخلايا. الثرب يوفر مساحة كبيرة لغرس، درجة عالية من البلاستيك، وفي الأوعية الدموية الكثيفة جنبا إلى جنب مع الإعداد داخل مثيرة للاهتمام لدراسة وجود النشاط الأيضي عالية8خلايا. أننا بحاجة إلى إنشاء تقنية جراحية السماح بنقل الخلايا والمائية في الثرب التالي. مستوحاة من lipofilling المستخدمة في الجراحة التجميلية9، قمنا بتطوير جزيرة مصفوفة ح Omental ملء النهج (صاروخ موجه). يتم حقن الجزر جزءا لا يتجزأ من المائية داخل الأنسجة أومينتال. التقنية تهدف أيضا إلى توفير انجرافتمينت كحد أقصى عن طريق استخدام إفادات متعددة من خليط الخلية والمائية الأنسجة أومينتال، وفيها عدد كبير من الأوعية الدموية ويحسن أيضا الأوكسجين الاختلاس.
في الدراسة الحالية، ويصف لنا تقنية بسيطة ومبتكرة لغرس جزيرة ليلى بين أوراق أومينتال، داخل الأنسجة الدهنية الأقرب إلى الأوعية الدموية. وهذا يتكون من جراحة الغازية الصغيرة، التي يمكن أن تنجز تحت تنظير البطن، مع حقن الجزر الصغيرة الواردة في المائية في الأنسجة الدهنية. هذا الأسلوب ينطبق بسهولة إلى كافة التركيبات المائية والخلية التي تحتاج إلى اختبار في في بيئة أيضي وظيفي.
ويمكن إبراز بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولاً، يجب أن يكون الشخص إجراء الجراحة، والتلاعب الأنسجة الحساسة مع الأنسجة الدهنية، كما أنها هشة. سحق أو إلحاق الضرر بها في الثرب تحتاج إلى تجنبها. الثرب، كنسيج دفاعية، هو إثراء في الضامة والكريات البيضاء الأخرى. هذه الخلايا المناعية يمكن تفعيلها من خلال التلاعب المفرط، ويمكن أن تؤثر سلبا الاختلاس. وثانيا، الابتزاز (خليط ايميا-hydrogel) تحميل الأهمية أيضا. الشخص الذي يقوم بالإجراء الذي يجب تجنب وحدات التخزين الميت ويجب تحميل كل من خليط المائية-جزيرة ليلى في جهاز الحقن. فورا بعد هذه الخطوة، هو نقطة حرجة أخرى حقن نفسه. يجب أن يتم الحقن ببطء، بعناية ودقة. يجب أن يتم مسح المحاقن بالمائية الفارغة تحميلها في البداية لاسترداد أي من الجزر الصغيرة المتبقية. وثالثاً، خياطة ويجب أن يتم بعناية وفي خطوتين. يجب خياطة الخطة العضلي أولاً، مع الحرص على عدم خياطة الثرب مع العضلات، وينبغي أن تكون خياطة الجلد بشكل منفصل. فيما يتعلق بإجراءات اكسبلانتيشن الفساد أومينتال، ينبغي إيلاء اهتمام خاص في هذه اللحظة عندما يتم قطعي الشرايين القريبة من المعدة (الشرايين المعدي). من المهم أن تولي اهتماما لأي نزيف التي تحدث ووقفها قبل خياطة الحيوان، كأي يؤدي النزيف المستمر إلى وفاة الحيوان في غضون عدة أيام.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تكون ضرورية فيما يتعلق بالوسيلة لحمل الجزر الصغيرة؛ اختيار المائية متروك المجرب، طالما المائية القابلة للحقن. يمكن أن يؤدي استخدام مواد مختلفة في متغير graft الدالة (مع أو بدون مكملات، على سبيل المثال). الأسلوب الموصوفة هنا أثبتت كفاءتها لمادة خاملة زرع يشترك مع نسبة إلى جزيرة ليلى لايك 7660/كغ.
الأسلوب الحالي قد تكون محدودة بحجم أومينتال والخصائص المائية. لاستخدام نموذج القوارض السكري، علاج الأنسولين إلزامي قبل غرس جزيرة ليلى لتوفير مجال تطعيم كافية. السكري القوارض تفقد الكثير من الوزن وكتلة الدهون سبب STZ-التي يسببها مرض السكري. نظراً لوزن الحيوانات المسجلين في هذه الدراسة الصغيرة، تطعيم في منطقة أصغر حتى من غير الممكن.
المحافظة على إدارة glycemia السليم (قبل زرع استخدام الكريات، وبعد ذلك استخدام الأنسولين طويل المفعول) إلزامي. وهنا اخترنا للحفاظ على بيليه الأنسولين حتى يوم زرع لعدة أسباب. أولاً، الحفاظ على التحكم نسبة السكر في الدم السليم إلى حد كبير يقلل من الأكسدة الناجمة عن مرض السكري في الأجهزة المتلقية، التي يمكن أن تكون ضارة لجزيرة ليلى الاختلاس11 ويتيح استمرار علاج الأنسولين المكثف والمستلم إعداد الملاحظة في العيادة12. ثانيا، كنا نرغب في تحديد العدد الأقصى لإجراءات التخدير للفئران. وفيما يتعلق بتنفيذ العلاج بالانسولين أثناء متابعة الأيضية استخدام الأنسولين طويل المفعول، تجنب مخطط يستخدم مضاعفات هائلة بسبب التسمم (والتي يمكن أن تدمر الطعوم) والمحافظة على قيمة جليسيميا “حقيقية”.
لمراقبة كفاءة الاختلاس، glycemia ليست معلمة ذات صلة في الأيام القليلة الأولى إذا الفئران يتم تلقي علاج الأنسولين استخدام الكريات. وهذا السبب في التحقق من مستوى الببتيد C السابقة عدة مرات زرع إلزامي. وتشمل هذه الأوقات في بداية الدراسة، لتحديد الحيوانات بعد حقن STZ، وثم السابقة فقط لزرع الأعضاء، لضمان بقاء الفئران السكري وأن التجديد الحد الأدنى.
الخصائص المائية أيضا مهمة. سوف تسرب السوائل المائية من الأنسجة أومينتال ولن تكون عالية اللزوجة المائية القابلة للحقن. اللزوجة المائية وإينجيكتابيليتي لفحصها قبل الاستخدام، ولكن يبدو من الضروري أيضا اختبار المواد مباشرة بالتقييم من جزيرة ليلى أو آخر بقاء الخلايا في المختبر. هنا، كالجزر الصغيرة حساسة جداً لنقص واستخدام الناقل عالية اللزوجة يمكن أن تؤثر على نشر الأوكسجين.
من حيث أهمية الأسلوب الموصوفة هنا فيما يتعلق بالأساليب القائمة، مزايا تقنية زرع الأنسجة داخل هذا المدى في إمكانية تكرار نتائج. هو أيضا أتروماتيك للأنسجة، وموقعها خارج الأوعية الدموية، يتجنب مخاطر النزيف وتجلط الدم. أيضا، عند النظر في زرع جزيرة ليلى، هو رد فعل فوري التهابات الدم بوساطة المتجنبة14. وعلاوة على ذلك، يسمح صاروخ موجه زرع الجزيرات إلى جهاز غير حيوية، خلافا لزرع الأعضاء في الكبد، والتي تمثل مخاطر فيما يتعلق بوظيفة الكبد15.
وقد المائية تحقيق الأداء الأمثل، أن تتكيف الخلايا فإنه سيحمل. استخدام عوامل النمو أو بروتينات معينة يمكن أن يكون لها تأثير إيجابي على الخلايا المزروعة16،17.
في الختام، يمكن استخدام هذا الأسلوب المجراة في التحقق من صحة من المائية على أنواع مختلفة من الخلايا، لا سيما عند الحاجة إلى بيئة الأيض نشطة، أما بالنسبة للجزر الصغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب الجراحي ينطبق على تطبيقات متعددة، ويمكن أن تكون، في المستقبل، سرعة قابل للتحويل إلى البشر، كما أنه يمكن تنفيذها بسهولة باستخدام تنظير البطن.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من منطقة الألزاس، بيوفاليي الألزاس بول بيوارتماتريكس-كقدم؛ 53/14/C1. الكتاب ممتنون للفريق للعلاقات العامة بروانت-رودير من ستراسبورغ فلورنسا تجمع للمساعدة في تطوير هذه التقنية المبتكرة.
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |