在这里, 我们提出了一个基于水凝胶的细胞疗法的体内验证方案, 并以胰岛移植为例进行了说明。h-Omental 矩阵 isle filling (h份) 植入术允许细胞-水凝胶混合物在血管附近的腹部之间植入, 以最大限度地植入适当的代谢环境。
基于细胞疗法的再生医学代表了治疗疾病的新希望。目前的障碍包括适当的体内验证的治疗效率。为了转移到受物体, 细胞往往需要与生物材料结合, 特别是水凝胶。然而, 验证这种嫁接的有效性需要正确的环境, 正确的水凝胶, 和正确的接受者的位置。动量可能是这样一个网站。以胰岛移植为例, 开发了 h名-ootig特·胰岛文件技术, 该技术包括在组织内注入移植物, 在两层之间, 以改善胰岛植入和生存。为了实现这一目标, 胰岛必须嵌入到粘度的水凝胶中, 使其能够使用无毛针头进行注射。注射器上装着水凝胶和小岛的组合。在不同的入口点进行了几次注射, 并沿着一条线进行了胰岛水凝胶混合物的沉积。我们测试了这种创新方法的可行性使用糊精珠。珠子很好地扩散到整个口腔组织中, 靠近血管。为了测试移植的有效性, 我们移植小岛到糖尿病大鼠, 并在两个月内进行代谢随访。移植的小岛在胰岛周围和内部的再血管化率很高, 并逆转了糖尿病。霍明技术可适用于其他类型的水凝胶或细胞疗法, 适用于具有高代谢活性的细胞。
细胞疗法是一个热门话题, 因为它旨在以再生医学为基础的疾病治疗。近年来, 生物材料辅助细胞疗法的研究越来越多, 特别是因为细胞植入往往需要一个载体来将细胞从培养皿转移到接受者。生物材料支架是潜在的有价值的细胞载体, 履行几个角色1。一个有能力的载体应该保护细胞免受机械压力, 并提供良好的生长条件, 如基本生长因子、代谢废物排泄、营养物质交换和氧气2。
在细胞治疗中使用的不同类型的生物材料中, 水凝胶有许多优点。它们具有生物相容性, 可生物降解, 易于处理, 并促进氧气扩散3。此外, 目前的技术允许使用水凝胶来帮助细胞生存和移植, 例如, 补充生长因子或细胞外基质蛋白 4。
含有干细胞的水凝胶载体可以作为治疗方法注射 , 例如骨再生5和神经系统疾病6。需要植入代谢活性细胞。虽然这种方法的体外验证是可能的, 但体内验证的工具和技术仍有待完善。
细胞和水凝胶移植可以很容易地进行皮下注射时, 生物相容性试验。然而, 当移植细胞是为了调节系统因素, 他们的代谢行动, 这种皮下定位不是最佳的, 基本上在静脉引流7。因此, 目前还没有工具来快速、安全和有效地评估水凝胶的有益效果。根据胰岛移植的例子, 即要求激素从移植物中释放到血液中, 以响应血糖水平, 我们开发了一种新的细胞水凝胶在体内植入的方法。
第一步是确定受体移植位点, 它可以接受带有细胞的水凝胶。动量为植入提供了很大的空间, 具有很高的可塑性, 其致密的血管化与腹腔内的设置相结合, 对于研究具有高代谢活性的细胞来说是很有趣的8。接下来我们需要建立一种手术技术, 允许细胞和水凝胶转移到动量中。在整形外科9中使用的填充物的启发下, 我们开发了 h-oiged 矩阵子文件 (homing) 方法。嵌入水凝胶中的胰岛被注射到口腔组织内。该技术还旨在提供最大的移植利用细胞和水凝胶混合物的多个沉积到口腔组织, 其中大量的血管也改善移植氧。
在本研究中, 我们描述了一种简单和创新的技术, 用于胰岛植入之间的胎盘, 在脂肪组织中最接近血管。这包括微创手术, 这可以在腹腔镜下完成, 与注射胰岛在水凝胶的脂肪组织。这项技术很容易适用于所有需要在代谢功能环境中测试的水凝胶和细胞组合。
本协议中可以突出显示一些关键步骤。首先, 执行手术和操作组织的人必须与脂肪组织是微妙的, 因为它是脆弱的。需要避免粉碎或损坏动量。髓质作为一种防御性组织, 在巨噬细胞和其他白细胞中富集。这些免疫细胞可以通过过度的操作激活, 并可能对移植物产生负面影响。其次, 移植物 (胰岛-水凝胶混合物) 负载也是至关重要的。执行该程序的人员必须避免死卷, 并且必须将所有的水-islet 混合物装入注射装置。在这一步骤之后, 另一个关键点是注入本身。注射必须缓慢, 小心, 和微妙。注射器必须通过最初装载的空水凝胶冲洗, 以回收任何剩余的胰岛。第三, 缝合必须谨慎地分两个步骤进行。肌肉计划应首先缝合 , 注意不要用肌合动量 , 皮肤应分开缝合。关于口腔移植的移植程序, 在胃附近的动脉 (胃内动脉) 被切开时, 应特别注意。重要的是要注意发生的任何出血, 并在缝合动物之前阻止它们, 因为任何持续的出血都会在几天内导致动物死亡。
可能需要对携带小岛的介质进行故障排除;只要可以注射水凝胶, 水凝胶的选择就由实验者决定。使用不同的材料可能会导致可变的移植功能 (例如, 有或没有补充)。这里描述的方法已经证明了它的效率, 惰性共移植材料与小岛比率为 7660 ieqkg。
本方法可能受到其尺寸和水凝胶性能的限制。要使用糖尿病啮齿类动物模型, 胰岛素治疗是强制性的胰岛植入术前, 以提供足够的移植面积。糖尿病啮齿类动物由于 stz 引起的糖尿病而减掉了大量的体重和脂肪。考虑到这项研究中动物的重量较小, 在更小的区域嫁接是不可能的。
保护适当的血糖管理 (移植前使用颗粒和之后使用长效胰岛素) 是强制性的。在这里, 我们选择保存胰岛素颗粒, 直到移植的那一天, 原因有几个。首先, 维持适当的血糖控制大大减少了糖尿病在受体细胞器官中引起的氧化应激, 这对胰岛移植11是有害的, 并允许继续进行强化胰岛素治疗和接受者在诊所12观察到的准备。其次, 我们想限制大鼠麻醉程序的最大数量。关于在使用长效胰岛素的代谢随访中实施胰岛素治疗, 该计划避免了由于葡萄糖毒性 (这可能破坏移植) 造成的大量并发症, 并保存 “真正的” 血糖值。
为了监测移植效率, 如果老鼠正在使用颗粒进行胰岛素治疗, 血糖在最初几天并不是相关的参数。这就是为什么在移植前多次检查 c 肽水平是强制性的。这些时间包括在研究开始时, 选择 stz 注射后的动物, 然后在移植之前, 以确保大鼠保持糖尿病, 并使再生最小。
水凝胶特性也很重要。液体水凝胶会从口腔组织中泄漏出来, 高粘性水凝胶也不会被注射。水凝胶粘度和注射性必须在使用前进行测试, 但似乎也必须通过评估胰岛或其他细胞在体外的存活情况直接测试材料。在这里, 由于小岛对缺氧非常敏感, 使用高度黏性的载体会影响氧气扩散。
就本文所述方法相对于现有方法的重要性而言, 这种组织内移植技术在重现性方面具有优势。它也是无创的组织, 并由于其血管外的位置, 避免出血和血栓形成的风险。另外, 在考虑胰岛移植时, 可避免瞬时血液介导的炎症反应14。此外, 与移植到肝脏不同的是, homing 允许将胰岛移植到非生命器官中, 这对肝功能造成了风险。
为了产生最佳性能, 水凝胶必须适应它将携带的细胞。生长因子或特定蛋白质的使用可对移植细胞16、17 产生积极影响。
总之, 这种技术可用于水凝胶在不同细胞类型上的体内验证, 特别是在需要活跃代谢环境的情况下, 如小岛。此外, 这种手术技术适用于多种应用, 将来可以迅速转移到人类, 因为它可以很容易地使用腹腔镜进行。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由雷吉翁·阿尔萨斯、biarartmatrix-póle alsace biovalley-cqdm 资助;53件/c1。提交人感谢斯特拉斯堡大学的 bruint-rolier pr. 团队帮助开发了这一创新技术。
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |