Qui, presentiamo un protocollo per la convalida in vivo della terapia cellulare basata su idrogel, illustrata dall’esempio del trapianto di insule pancreatiche. h-omentale isolotto di Matrix (hOMING) l’impianto di riempimento permette l’impianto di una miscela di cella-idrogel tra gli strati omentale, vicino ai vasi sanguigni, per massimizzare l’attecchimento in un ambiente metabolico adeguato.
Medicina rigenerativa basata sulla terapia cellulare rappresenta una nuova speranza per curare la malattia. Gli attuali ostacoli includono convalida corretta in vivo dell’efficienza della terapia. Per il trasferimento al corpo del destinatario, le cellule hanno bisogno spesso di essere combinati con biomateriali, soprattutto idrogeli. Tuttavia, la convalida dell’efficacia di tali un innesto richiede l’ambiente giusto, la giusta idrogel e il sito proprio destinatario. L’omento potrebbe essere un tale sito. Sulla base dell’esempio di trapianto dell’isolotto, abbiamo sviluppato la tecnica hOMING (h-omentale riempimento dell’isolotto di Matrix), che consiste dell’iniezione dell’innesto all’interno dei tessuti, tra gli strati omentali, per migliorare la sopravvivenza e l’impianto dell’isolotto. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario essere incorporato in un idrogel con una viscosità che consente la sua iniezione utilizzando un ago atraumatico isolotti. Siringhe sono caricati con una combinazione di idrogel e isolotti. Diverse iniezioni vengono eseguite all’interno del tessuto omentale presso punti di ingresso diversi, e la deposizione della miscela dell’isolotto/idrogel avviene lungo una linea. Abbiamo testato la fattibilità di questo approccio innovativo usando le perle di destrano. Le perle erano ben distribuite in tutto il tessuto omentale, in prossimità di vasi sanguigni. Per testare l’efficacia dell’innesto, abbiamo trapiantato isolotti in ratti diabetici ed eseguire un follow-up metabolico più di due mesi. Isole trapiantate hanno esibito un alto tasso di ri-vascolarizzazione attorno e all’interno di isolotti e invertito il diabete. La tecnica di hOMING potrebbe essere applicabile per altri tipi di terapia idrogel o delle cellule, cellule con alta attività metabolica.
Terapia cellulare è un tema caldo, come ha lo scopo di curare malattie basate sulla medicina rigenerativa. Terapie cellulari assistita da materiale biologico sono stati sempre più studiate negli ultimi anni, soprattutto perché l’impianto delle cellule spesso richiede un vettore per il trasferimento delle cellule dalla piastra di coltura al destinatario. Biomateriale ponteggi sono vettori di cellule potenzialmente importante che soddisfano diversi ruoli1. Un vettore competente dovrebbe proteggere le cellule da sollecitazioni meccaniche e fornire condizioni di crescita favorevoli, quali fattori di crescita essenziali, l’escrezione dei rifiuti metabolico, scambio di sostanze nutritive e ossigeno2.
Tra i diversi tipi di biomateriali utilizzati nella terapia cellulare, idrogeli hanno molti vantaggi. Essi sono biocompatibili, biodegradabile, facile da maneggiare e facilitare la diffusione di ossigeno3. Inoltre, la tecnologia attuale permette l’utilizzo di idrogel per aiutare le cellule sopravvivono e interdigitate con, ad esempio, il completamento con fattori di crescita o di proteine di matrice extra-cellulare4.
Vettori di idrogel contenenti cellule staminali possono essere iniettati come trattamenti, ad esempio, dell’osso rigenerazione5 e sistema nervoso malattia6. L’impianto di cellule metabolicamente attive è necessario. Mentre è possibile convalidare in vitro dell’approccio, strumenti e tecniche per la convalida in vivo rimangono per essere raffinato.
Trapianto delle cellule e idrogel facilmente può essere effettuato mediante iniezione sottocutanea quando sono condotte prove di biocompatibilità. Tuttavia, quando le cellule innestate sono destinate a regolare i fattori sistemici di loro azione metabolica, questa localizzazione sottocutanea non è ottima, essenzialmente in termini di drenaggio venoso7. Di conseguenza, non sono disponibili strumenti attuali in modo rapido, sicuro ed efficiente valutare gli effetti benefici di un idrogel. Sulla base dell’esempio di trapianto dell’isolotto, che richiede che gli ormoni rilasciati nel flusso sanguigno dall’innesto in risposta a livelli di glucosio nel sangue, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l’impianto delle cellule/idrogel in vivo.
Il primo passo era quello di identificare un sito accettore di trapianto, che può accettare un idrogel con cellule. L’omento offre un ampio spazio per l’impianto, è altamente plastico, e sua vascolarizzazione denso combinato con l’impostazione intraperitoneale è interessante per lo studio delle cellule che hanno alta attività metabolica8. Avanti abbiamo bisogno di stabilire una tecnica chirurgica che consente il trasferimento delle cellule e l’idrogel in omento. Ispirato il lipofilling utilizzato in chirurgia plastica9, abbiamo sviluppato l’isolotto di matrice h-omentale (hOMING) approccio di riempimento. Isolotti incorporati in idrogel vengono iniettati all’interno del tessuto omentale. La tecnica è anche finalizzato a fornire massimo attecchimento utilizzando più deposizioni di cella e idrogel della miscela nel tessuto omentale, dove il gran numero di vasi sanguigni inoltre migliora l’ossigenazione dell’innesto.
Nello studio presente, descriviamo una tecnica semplice ed innovativa per l’impianto dell’isolotto tra fogli omentale, all’interno del tessuto grasso più vicino ai vasi sanguigni. Si tratta di chirurgia micro-invasiva, che potrebbe essere completato in laparoscopia, con l’iniezione di isolotti contenute in un idrogel nel tessuto grasso. Questa tecnica è facilmente applicabile a tutte le combinazioni di idrogel e delle cellule che devono essere testati un in un ambiente metabolicamente funzionale.
Alcuni passaggi critici possono essere evidenziate nel presente protocollo. In primo luogo, la persona che esegue l’intervento chirurgico e manipolare i tessuti deve essere delicata con il tessuto grasso, come è fragile. Schiacciare o danneggiare l’omento deve essere evitato. Omento, come un tessuto difensivo, si arricchisce in macrofagi ed altri leucociti. Queste cellule immuni possono essere attivate tramite manipolazione eccessiva e potrebbero influenzare negativamente l’innesto. In secondo luogo, innesto (isolotto-idrogel miscela) caricamento è anche critico. La persona che esegue la procedura deve evitare i volumi morti e tutta la miscela di idrogel-isolotto deve caricare il dispositivo di iniezione. Subito dopo questo passaggio, un altro punto critico è l’iniezione stessa. Iniezione deve essere effettuata lentamente, con cura e delicatamente. La siringa deve essere lavata dall’idrogel vuoto caricato inizialmente per recuperare qualsiasi isolotti rimanenti. In terzo luogo, la sutura deve essere fatto con attenzione e in due passaggi. Il piano muscolare deve essere suturato in primo luogo, avendo cura di non per suturare l’omento con il muscolo, e la pelle deve essere suturata separatamente. Per quanto riguarda la procedura di espianto per l’innesto omentale, particolare attenzione dovrebbe essere presa al momento quando sono incise le arterie vicino allo stomaco (arterie gastroepiploica). È importante prestare attenzione alle eventuali emorragie che si verificano e fermarli prima sutura l’animale, come qualsiasi porta sanguinamento persistente alla morte animale entro alcuni giorni.
Risoluzione dei problemi può essere necessario per quanto riguarda il mezzo per il trasporto di isolotti; la scelta di idrogel spetta allo sperimentatore, fintanto che l’idrogel è iniettabile. L’uso di materiali diversi può provocare la variabile dell’innesto di funzione (con o senza il completamento, per esempio). Il metodo qui descritto ha dimostrato la sua efficienza per materiale inerte Co-trapianto con un rapporto dell’isolotto di 7660 IEQ/kg.
Il presente metodo può essere limitato dalle dimensioni omentale e proprietà di idrogel. Per utilizzare un modello di roditore diabetico, la terapia insulinica è obbligatoria prima dell’impianto dell’isolotto per fornire sufficiente area di innesto. Roditori diabetici perdono un sacco di peso e massa grassa a causa di diabete indotto STZ. Considerando il piccolo peso degli animali iscritti a questo studio, non è possibile l’innesto in un’area ancora più piccola.
Conservazione della glicemia corretta gestione (prima del trapianto usando le palline e da allora in poi usando l’insulina ad azione prolungata) è obbligatorio. Qui, abbiamo scelto di conservare il pellet di insulina fino al giorno del trapianto per diversi motivi. In primo luogo, il mantenimento di un controllo glicemico adeguato riduce notevolmente lo sforzo ossidativo indotto da diabete negli organi destinatari, che possono essere deleteri per isolotto innesto11 e permette la continuazione della terapia insulinica intensiva e destinatario preparazione osservata nella clinica12. In secondo luogo, abbiamo voluto limitare il numero massimo delle procedure di anestesia per i ratti. Per quanto riguarda l’attuazione della terapia dell’insulina durante il follow-up metabolico usando l’insulina ad azione prolungata, lo schema utilizzato evitato enormi complicazioni dovuto glucotossicità (che è in grado di distruggere gli innesti) e di conservare un valore di glicemia “reale”.
Per monitorare l’efficienza dell’innesto, glicemia non è un parametro rilevante nei primi giorni se ratti stanno ricevendo la terapia di insulina usando le palline. Ecco perché controllare il livello di C-peptide diverse volte prima di trapiantare è obbligatorio. Questi tempi sono all’inizio dello studio, per selezionare gli animali dopo l’iniezione di STZ e poi appena prima del trapianto, per garantire che i ratti rimangano diabetiche e che la rigenerazione è minima.
Proprietà di idrogel sono anche importanti. Idrogel liquido colerà fuori tessuto omentale e altamente viscosi idrogel non sarà iniettabili. Iniettabilità e idrogel viscosità deve essere testato prima dell’uso, ma sembra indispensabile per testare anche il materiale direttamente dalla valutazione dell’isolotto o un’altra sopravvivenza di cellule in vitro. Qui, come isolotti sono molto sensibili ad ipossia e l’uso di un vettore altamente viscoso può influenzare la diffusione dell’ossigeno.
In termini di entità del metodo descritto qui per quanto riguarda i metodi esistenti, questa tecnica di trapianto intra-tessuto ha benefici in termini di riproducibilità. È anche atraumatica per il tessuto e, grazie alla sua posizione extra-vascolare, evita i rischi di emorragie e trombosi. Inoltre, quando si considera il trapianto dell’isolotto, immediata reazione infiammatoria mediata dal sangue è evitato14. HOMING consente inoltre di trapianto isolotti in un organo non-vitale, a differenza di trapianto nel fegato, che costituisce un rischio in termini di funzionalità epatica15.
Per ottenere prestazioni ottimali, deve essere adattata alle cellule che porterà un idrogel. Uso di fattori di crescita o proteine specifiche possa avere un effetto positivo su cellule trapiantate16,17.
Per concludere, questa tecnica può essere utilizzata per la convalida in vivo di un idrogel su tipi cellulari differenti, soprattutto quando è necessario un ambiente metabolico attivo, per quanto riguarda gli isolotti. Inoltre, questa tecnica chirurgica è applicabile a più applicazioni e potrebbe essere, in futuro, rapidamente trasferibile agli esseri umani, come può essere facilmente eseguita mediante laparoscopia.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dalla Région Alsace, CQDM-BioArtMAtrix-Pôle Alsazia Biovalley; 53/14/C1. Gli autori sono grati al team di Pr. Bruant-Rodier dal Hôpitaux Universitaires de Strasburgo per aiutare a sviluppare questa tecnica innovativa.
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |