ここでは、ハイドロゲルを用いた細胞療法、膵島移植の例の生体内での検証のためのプロトコルを提案する.h 大網マトリックス アイレット (ホーミング) 注入充填により適切な代謝環境の生着を最大化するために、血管の近くに、大網の層間細胞ヒドロゲル混合物の注入ができます。
細胞療法に基づいた再生医療は、病気を治すための新しい希望を表します。現在の障害は、治療の効率の適切な体内検証を組み込みます。受信者の本体への転送での細胞はしばしば生体材料、特にゲルと組み合わせる必要があります。しかし、このような移植の有効性の検証には、適切な環境、右ハイドロゲルと右受信者のサイトが必要です。大網のようなサイトがあります。膵島移植の例に基づいて、移植膵島移植と生存率を改善するために、大網の層の間に、組織内の注入から成っているホーミング (マトリックス小島 h 大網充填) 技術を開発しました。これを実現する、小島は粘度の非外科的針を使用して注入を可能にするハイドロゲルに埋め込まれるあります。注射器は、ハイドロゲルと小島の組み合わせで読み込まれます。別のエントリ ポイントで大網組織内いくつかの注射で行なうし、アイレット/ヒドロゲル混合物の沈着が線に沿って作られました。デキストラン ビーズを用いたこの革新的なアプローチの可能性をテストしました。ビーズも、血管に近接、大網の組織で普及しました。移植の有効性をテストするために糖尿病ラット膵島を移植し、代謝のフォロー アップ 2 ヶ月以上を実行します。移植膵島は再血管周りや小島内部の高レートを展示、糖尿病を逆転させた。ホーミングの技術は、ゲルまたは細胞療法は、高い代謝活性と細胞の他のタイプに適用可能性があります。
それは再生医療に基づく病気を治すことを目的として、細胞療法はホットな話題です。生物学的材料による細胞治療は、細胞の移植による多くの場合は、受信者に培養皿からセルを転送するためのキャリアを必要とするために特に近年、多く研究されています。生体材料足場は、いくつかのロール1を満たす可能性のある携帯電話事業者です。有能なキャリアは、機械的ストレスから細胞を保護し、成長の重要な要因、代謝廃棄物の排泄、栄養物質と酸素2の交換などの良好な生育条件を提供ください。
細胞療法に使用される生体材料の種類、ヒドロゲル多くの利点があります。生体適合性、生分解性、処理、および酸素の拡散3を容易にするために簡単です。さらに、現在の技術では、細胞の存続および成長因子や細胞外マトリックス蛋白質4補充などで接がを支援するヒドロゲルの使用ができます。
治療、幹細胞を含むハイドロゲル キャリアを注入できる例えば、骨の再生5と神経系疾患6。代謝活性の高い細胞の注入が必要です。アプローチの in vitro における検証が可能ですが、ツールや生体内での検証のテクニックは洗練されたままです。
細胞とゲル移植簡単に行えます皮下注入による生体適合性テストを実施します。ただし、移植細胞の代謝作用によって全身的要因を調節するためのものなとき、この皮下のローカライズが静脈還流7に関して本質的に最適。したがって、迅速に、安全に、かつ効率的にハイドロゲルの有益な効果を評価するための現在のツールはありません。ホルモンは、血糖値に応じてグラフト血流に解放されることを必要とする膵島移植の例に基づいて新しい体内細胞/ゲル注入法を開発しました。
最初のステップは、セルを持つハイドロゲルを受け入れることができる受容移植サイトを識別するためにだった。大網の大空間を提供しています, 移植は非常にプラスチック製や腹腔内の設定と組み合わせることの密な血管新生が8高い代謝活性を有する細胞の研究のための興味深い。次に、大網にセルとヒドロゲルへの転送を許可する手技を確立する必要があります。整形外科9で使用される lipofilling に触発され、(ホーミング) アプローチを充填 h 大網のマトリックスの膵島を開発しました。ハイドロゲルに埋め込まれた小島は、大網の組織内注入されます。テクニックも血管の多数はまた移植酸素を向上、大網の組織に細胞とゲル混合物の複数の証言を活用し、最大の生着を提供を目指します。
本研究では脂肪組織の血管に最も近い内部の大網シート間膵島移植へのシンプルかつ革新的な手法について述べる。これは腹腔鏡下完了でした、マイクロ侵襲外科の脂肪質のティッシュに、ゲルに含まれる島の注入で構成されます。この手法でテストする必要がありますすべてのハイドロゲルとセルの組み合わせによって、簡単に該当する、代謝機能を備えた環境で。
このプロトコルには、いくつかの重要なステップを強調できます。最初に、それは壊れやすい、手術を実行して、組織を操作する人が脂肪質のティッシュで繊細な必要があります。破砕や大網の破損を回避する必要があります。大網、防御的な組織として、大食細胞および他の白血球に濃縮されています。これらの免疫細胞過剰操作によって実行される、移植に悪影響を及ぼす可能性があります。第二に、移植 (膵島ヒドロゲル混合物) の読み込みも重要です。手順を実行する人は、デッド ボリュームを避ける必要があり、噴射装置にハイドロゲル膵島の混合物のすべてを読み込む必要があります。この手順の直後に別の重要なポイントは、注射そのものです。注入は、ケアと繊細なゆっくりと実行する必要があります。注射器は、任意の残りの島を取得するために最初に読み込まれる空のハイドロゲルによるフラッシュしなければなりません。第三に、縫合を慎重に、そして 2 つの手順で行う必要があります。筋肉で大網を縫合しないように世話筋計画する必要があります最初に、縫合して皮膚は別々 に縫合する必要があります。大網移植植手続きとしては、特別な注意は、現時点では胃 (胃大網動脈) に近い動脈を切開するとき取られるべき。発生し、数日で動物の死に任意の持続的な出血のリードとして、動物を縫合する前にそれらを停止出血に注意を払うことが重要です。
トラブルシューティングが必要な媒体に関する運ぶためになる島;ヒドロゲルは注射がある限り、ハイドロゲルの選択は、実験者次第です。さまざまな材料の使い方が変数になる関数 (たとえば、補充の有無にかかわらず) を移植します。ここで説明する方法は、小島比 7660 IEQ/kg の不活性共同移植材料の効率を実証しています。
本法は、大網のサイズとヒドロゲルの物性によって制限があります。糖尿病性の齧歯動物モデルを使用するには、インスリン療法は十分な移植領域を提供する膵島移植前に必須です。糖尿病性の齧歯動物は、体重、STZ 誘発糖尿病による脂肪の多くを失います。本研究の動物の小さい重量を考慮してさらに小さい領域に移植は不可能です。
(移植ペレットを使用し、その後長時間作用型インスリンを使用して) 前に適切な血糖管理の保全は必須です。ここでは、我々 はいくつかの理由のための移植の日までインスリン ペレットを節約するために選んだ。まず、適切な血糖コントロールの維持がかなり糖尿病インスリン療法と受信者の継続ができ、膵島移植11有害することができます受信者の臓器によって誘発される酸化ストレスを軽減します。クリニック12の観察の準備。第二に、我々 はラットの麻酔手順の最大数を制限したかった。長時間作用型のインスリンを使用して代謝の経過観察中にインスリン療法の実施、に関して使用されるスキームは glucotoxicity (これは移植を破壊できる) ため、「本物の」血糖値を節約するために大規模な合併症を避けます。
グラフト効率を監視するには、血糖パラメーターではありません関連する最初の数日間のラットは、ペレットを用いたインスリン療法を受けている場合。だからこそ、移植する C-ペプチド レベル何回か前は必須チェックです。STZ 投与後動物を選択する、研究の始まりで、ちょうどラットまま糖尿病と再生が最小限であることを確保するため、移植の前にこれらの時間が含まれます。
ヒドロゲルの物性は、また重要です。液体ゲルが大網組織に漏れて、粘性の高いゲルは注射できません。ハイドロゲル粘度と injectability は、使用前にテストするがまた膵島の細胞生存率の in vitro 別評価による直接材料をテストするのには不可欠であります。ここでは、島は低酸素血症と高粘度のキャリアの使用に非常に敏感、酸素の拡散を及ぼします。
既存のメソッドここで説明する方法の重要性この内組織移植手法的には再現性の利点があります。それはまた、組織の非外科的、出血と血栓症のリスクを避けるためにその余分な血管の場所。また、膵島移植を検討するとき、インスタントの血液を介した炎症反応は回避14です。さらに、ホーミングは肝機能15面でのリスクが肝臓への移植とは異なり、非重要な臓器に膵島を移植できます。
最適なパフォーマンスを生産するには、ハイドロゲルがそれを運ぶ、細胞に適応します。成長因子や特定の蛋白質の使用は、移植細胞16,17に肯定的な効果を持つことができます。
最後に、小島は、アクティブな代謝環境が必要な場合に特に異なったセルタイプにハイドロゲルの生体内での検証のためこの手法を使用できます。また、この手技は複数のアプリケーションに適用されます、かもしれない、将来的に、それが簡単に行えます腹腔鏡を使用して、人間に急速に譲渡すること。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、アルザス地方、BioArtMAtrix 極アルザス バイオバレー-CQDM; によって賄われていた53/14/C1。著者は、この革新的な技術の開発を助けるため Hôpitaux Universitaires de ストラスブールからの広報ブリュアン付近ロディエのチームに感謝しています。
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |