Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur in-vivo Validierung der Hydrogel-basierte Zelltherapie, zeigt das Beispiel der Inselversetzung. h-omentalis Matrix Inselchen füllen (hOMING) Implantation ermöglicht die Implantation einer Zelle-Hydrogel-Mischung zwischen den omentalis Schichten, in der Nähe von Blutgefäßen Engraftment in eine richtige metabolische Umgebung zu maximieren.
Regenerativer Medizin basierend auf Zell-Therapie stellt eine neue Hoffnung für die Heilung von Krankheiten. Aktuelle Hindernisse sind richtige in Vivo Validierung von der Wirksamkeit der Therapie. Für die Übertragung an den Empfänger Körper Zellen oft mit Biomaterialien, vor allem Hydrogele kombiniert werden müssen. Überprüfung der Wirksamkeit von solch einem Transplantat erfordert jedoch das richtige Umfeld, die richtige Hydrogel und rechts Empfängerstelle. Das Omentum möglicherweise eine solche Site. Basierend auf dem Beispiel der Inselversetzung, entwickelten wir das hOMING (h-omentalis Matrix Islet) Abfülltechnik, bestehend aus der Injektion des Transplantats innerhalb des Gewebes zwischen den omentalis Schichten Inselchen Implantation und das Überleben verbessern. Um dies zu erreichen, haben kleine Inseln in einem Hydrogel mit einer Viskosität eingebettet werden, die eine Injektion mit einer atraumatischen Nadel ermöglicht. Spritzen werden mit einer Kombination von Hydrogel und Inselchen geladen. Mehrere Injektionen erfolgen innerhalb des omentalis Gewebes an verschiedenen Einstiegspunkten und die Ablagerung von der Insel/Hydrogel-Mischung erfolgt entlang einer Linie. Wir testeten die Machbarkeit dieser innovative Ansatz mit Dextran-Perlen. Die Perlen waren die omentalis Gewebe, in unmittelbarer Nähe zu den Blutgefäßen gut verteilen. Um die Wirksamkeit des Transplantats zu testen, wir Inselchen in diabetischen Ratten verpflanzt und führen eine metabolische Follow-up über zwei Monate. Die verpflanzten kleinen Inseln stellte eine hohe Rate von Re Vaskularisierung rund um und im Inneren der Inseln und umgekehrt Diabetes. Die zielsuchende Technik könnte für andere Arten von Hydrogel oder Zelle Therapie für Zellen mit hoher Stoffwechselaktivität anwendbar.
Zelltherapie ist ein heißes Thema, da es darum geht, Krankheiten anhand der regenerativen Medizin zu heilen. Biologisches Material-gestützte Zelltherapien sind zunehmend in den letzten Jahren untersucht worden, vor allem, weil Zelle Implantation häufig einen Träger für die Übertragung der Zellen aus der Kulturschale an den Empfänger erfordert. Biomaterial Gerüste sind potentiell wertvolle Zellträger, die mehrere Rollen1erfüllen. Zuständigen Träger sollten schützen Zellen vor mechanischen Belastungen und bieten günstige Wachstumsbedingungen, wie wesentliche Wachstumsfaktoren, metabolische Abfall Ausscheidung, Austausch von Nährsubstanzen und Sauerstoff2.
Unter den verschiedenen Arten von Biomaterialien für die Zelltherapie haben Hydrogele viele Vorteile. Sie sind biokompatibel, biologisch abbaubar, einfach zu handhaben, und Sauerstoff Diffusion3erleichtern. Darüber hinaus ermöglicht Stand der Technik den Einsatz von Hydrogele, um Zellen überleben und mit z. B. Supplementierung mit Wachstumsfaktoren oder extrazellulären Matrix Proteine4weiterhin zu helfen.
Hydrogel-Träger mit Stammzellen können injiziert werden, wie Behandlungen, z. B. Knochen Regeneration5 und Nervensystem Krankheit6. Die Implantation von metabolisch aktiven Zellen ist notwendig. In-vitro-Validierung des Ansatzes ist, zwar möglich bleiben Werkzeuge und Techniken zur in-vivo Validierung um verfeinert werden.
Zelle und Hydrogel-Transplantation kann leicht durch subkutane Injektion erfolgen, wenn Biokompatibilität Tests durchgeführt werden. Bei transplantierten Zellen systemische Faktoren regulieren durch ihre metabolische Wirkung sollen, ist jedoch dieser subkutanen Lokalisierung nicht optimal, im Wesentlichen in Bezug auf die venösen Abfluss7. Daher gibt es keine aktuellen Tools, schnell, sicher und effizient die wohltuende Wirkung von einem Hydrogel zu bewerten. Am Beispiel der Inselversetzung, die erfordert, dass Hormone in den Blutstrom aus dem Transplantat als Reaktion auf den Blutzuckerspiegel freigesetzt werden, haben wir eine neue Methode zur in-vivo Zelle/Hydrogel-Implantation entwickelt.
Der erste Schritt war eine Akzeptor-Transplantation-Website identifizieren, die ein Hydrogel mit Zellen annehmen kann. Das Omentum bietet einen großen Raum für die Implantation ist sehr plastisch, und seine Dichte Vaskularisierung, kombiniert mit der intraperitonealen Einstellung ist interessant für die Untersuchung von Zellen mit hoher Stoffwechselaktivität8. Als nächstes mussten wir eine chirurgische Technik ermöglicht die Übertragung der Zellen und die Hydrogel in das Omentum zu etablieren. Inspiriert durch das Lipofilling, plastische Chirurgie9verwendet, entwickelten wir die h-omentalis Matrix-Insel (hOMING) Ansatz zu füllen. Inselchen in Hydrogel eingebettet sind im Inneren die omentalis Gewebe injiziert. Auch soll die Technik bieten maximale Engraftment durch die Verwendung mehrere Ablagerungen von der Zelle und Hydrogel-Gemisch in die omentalis Gewebe, wo die große Zahl der Blutgefäße verbessert auch die Sauerstoffversorgung der Graft.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine einfache und innovative Technik für die Inselchen Implantation zwischen omentalis Laken, in das Fettgewebe am nächsten an den Blutgefäßen. Dieser besteht aus Mikro-invasive Chirurgie, die unter Laparoskopie abgeschlossen werden konnte, mit der Injektion von Inseln in einem Hydrogel in das Fettgewebe enthalten. Diese Technik ist leicht anwendbar, alle Kombinationen von Hydrogel und Zelle, die getestet werden müssen ein in eine metabolisch funktionsfähige Umgebung.
Einige wichtige Schritte können in diesem Protokoll hervorgehoben werden. Erstens muss die Person, die Durchführung der Operation und die Gewebe zu manipulieren zart mit dem Fettgewebe sein, wie zerbrechlich ist. Zerkleinerung oder eine Beschädigung der Omentum muss vermieden werden. Omentum, wird als eine defensive Gewebe Makrophagen und andere Leukozyten angereichert. Diese Immunzellen durch übermäßige Manipulation aktiviert werden können und könnte sich negativ auf das Transplantat. Zweitens ist Transplantat (Insel-Hydrogel Mischung) laden auch kritisch. Die Person, die Durchführung des Verfahrens muss Totvolumina vermeiden und laden Sie alle das Hydrogel-Insel-Gemisch muss in der Injektionsvorrichtung. Unmittelbar nach diesem Schritt ist ein weiterer kritischer Punkt die Injektion selbst. Injektion muss langsam, sorgfältig und vorsichtig durchgeführt werden. Die Spritze muss durch die leeren Hydrogel zunächst geladen, um alle verbleibenden Inselchen abrufen gespült werden. Drittens muss Nähen sorgfältig und in zwei Schritten erfolgen. Der muskulöse Plan sollte sein vernäht zuerst kümmert sich nicht um das Omentum mit den Muskel, Naht und die Haut sollte separat vernäht. Bezüglich der Explantation-Verfahrens für die omentalis Graft sollte besondere Aufmerksamkeit im Moment genommen werden, wenn die Arterien in der Nähe des Magens (Gastroepiploic Arterien) eingeschnitten sind. Es ist wichtig, Blutungen achten, die auftreten, und beenden Sie sie vor dem Nähen des Tieres da zu tierischen Tod innerhalb einiger Tage anhaltende Blutungen führt.
Fehlersuche kann über das Medium notwendig für den Transport von kleinen Inseln; die Wahl von Hydrogel liegt der Experimentator, solange das Hydrogel injizierbare ist. Die Verwendung unterschiedlicher Materialien kann in Variablen führen Transplantat Funktion (mit oder ohne Supplementierung, zum Beispiel). Die hier beschriebene Methode hat ihre Effizienz für Co verpflanzend Inertmaterial mit einem Insel-Verhältnis von 7660 IEQ/kg nachgewiesen.
Das vorliegende Verfahren kann durch die omentalis Größe und Hydrogel Eigenschaften beschränkt werden. Um eine diabetische Nagetier Modell zu verwenden, ist Insulin-Therapie vor der Insel Implantation ausreichend Pfropfen Bereich obligatorisch. Diabetische Nagetiere verlieren viel Gewicht und Fettmasse aufgrund von STZ-induzierte Diabetes. In Anbetracht des geringen Gewichts der Tiere in diese Studie aufgenommen ist es nicht möglich, in einem noch kleineren Bereich Pfropfen.
Erhaltung der richtigen Glycemia Management (vor Transplantation mit Pellets und danach mit langwirksamen Insulin) ist obligatorisch. Hier haben wir das Insulin Pellet bis zu dem Tag der Transplantation aus mehreren Gründen zu sparen. Erstens reduziert die Wartung von einem richtigen glykämischen Kontrolle oxidativen Stress induziert durch Diabetes in den Empfänger Organen, die schädlich für Islet Transplantation11 und ermöglicht die Fortsetzung der intensiven Insulintherapie und Empfänger Vorbereitung in der Klinik12beobachtet. Zweitens wollten wir die maximale Anzahl der Anästhesieverfahren für die Ratten. Hinsichtlich der Durchführung der Insulintherapie während der metabolische Follow-up mit langwirksamen Insulin vermieden das Schema verwendet massive Komplikationen aufgrund von Glucotoxicity (die Transplantate zerstören kann) und einen “echten” Glycemia Wert zu erhalten.
Um Transplantat Effizienz zu überwachen, ist Glycemia nicht relevanten Parameter in den ersten Tagen, wenn Ratten Insulintherapie mit Pellets erhalten. Deshalb überprüfen, dass das C-Peptid-Niveau mehrmals vor Transplantation obligatorisch ist. Diese Zeiten gehören zu Beginn der Studie, Tiere nach STZ Injektion auswählen und dann nur vor Transplantation, um sicherzustellen, dass Ratten Diabetiker bleiben und Regeneration minimal ist.
Hydrogel Eigenschaften sind ebenfalls wichtig. Flüssige Hydrogel wird aus omentalis Gewebe auslaufen und hochviskosen Hydrogel werden nicht injizierbare. Hydrogel Viskosität und Injectability muss vor der Anwendung getestet werden, aber es scheint wichtig, auch das Material direkt durch Auswertung der Insel oder eine andere Zellen überleben in-vitro-test. Hier, wie Inseln sehr empfindlich gegen Hypoxie und die Verwendung von hochviskosen Träger sind können Sauerstoffdiffusion beeinflussen.
In Bezug auf die Bedeutung der Methode hier in Bezug auf bestehende Methoden beschrieben hat dieser Intra-Gewebe Transplantation Technik Vorteile in Bezug auf die Reproduzierbarkeit. Es ist auch atraumatisch für das Gewebe und wegen seiner extra vaskulären Lage vermeidet Risiken Blutung und Thrombose. Auch bei der Inselversetzung ist sofort Blut-vermittelte Entzündungsreaktion vermieden14. Darüber hinaus ermöglicht hOMING Umpflanzen Inselchen in ein nicht-lebenswichtiges Organ, im Gegensatz zu Transplantation in die Leber, die Risiken in Bezug auf die Leberfunktion15mit sich bringt.
Um optimale Leistung zu erzielen, muss ein Hydrogel Zellen angepasst werden, die es tragen wird. Einsatz von Wachstumsfaktoren oder spezifische Proteine haben eine positive Wirkung auf die transplantierten Zellen16,17.
Abschließend möchte ich sagen, kann diese Technik zur in-vivo Validierung ein Hydrogel auf verschiedenen Zelltypen, verwendet werden, vor allem, wenn eine aktive metabolische Umgebung, wie bei kleinen Inseln benötigt wird. Darüber hinaus diese Operationstechnik gilt für mehrere Anwendungen und könnte in Zukunft schnell übertragbar auf den Menschen, wie es mit Laparoskopie leicht durchgeführt werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von Région Alsace, BioArtMAtrix-Pôle Alsace Biovalley-CQDM finanziert; 53/14/C1. Die Autoren sind dankbar für das Team von Pr. Bruant-Rodier von Hôpitaux Universitaires de Strasbourg für Hilfe bei der Entwicklung dieser innovativen Technik.
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |