Efectos del gusto señalización abolición de proteína sobre la inflamación intestinal en un modelo de ratón de la enfermedad inflamatoria intestinal
Summary
Aquí presentamos un protocolo para investigar el efecto de la anulación de los genes relacionados con la gustación de respuesta inmune en un sodio de sulfato de dextrano (DSS)-inducida por el modelo de ratón inflamatoria intestinal (EII) de la enfermedad.
Abstract
Enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es uno de los trastornos gastrointestinales relacionados con inmune, incluyendo la colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, que afecta a la calidad de vida de millones de personas en todo el mundo. EII los síntomas incluyen dolor abdominal, diarrea y sangrado rectal, que pueden resultar de las interacciones entre la microbiota intestinal, los componentes del alimento, las células epiteliales intestinales y las células inmunes. Es de particular importancia para evaluar cómo afecta cada gen clave expresado en las células intestinales epiteliales e inmunes la inflamación en el colon. Se han encontrado receptores de sabor acoplado a proteínas G, como G proteína subunidad α-gustducin y otras proteínas de señalización, en los intestinos. Aquí, utilizamos α-gustducin como representante y describir un sodio de sulfato de dextrano (DSS)-inducida por el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal para evaluar el efecto de mutaciones en el gen gustativa en inmunidad mucosa intestinal y la inflamación. Este método combina tecnología de knockout de genes con el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal inducido químicamente y por lo tanto puede ser aplicado para evaluar el resultado de la anulación del gen gustativa, así como otros genes que pueden exuberate o atenuar la respuesta inmune inducida por DSS en el colon. Ratones mutantes son administrados con DSS para un cierto período durante el cual su peso corporal, taburete y sangría rectal son monitoreados y grabados. En diferentes puntos de tiempo durante la administración, algunos ratones son sacrificados, luego se miden los tamaños y pesos de sus bazos y dos puntos y los tejidos del intestino se recogen y procesan para histológicos y análisis de expresión génica. Los datos muestran que los resultados de octavos de final de α-gustducin en pérdida excesiva de peso, diarrea, hemorragias intestinales, daño tisular y la inflamación vs salvaje-tipo ratones. Puesto que la gravedad de la inflamación inducida es afectada por las cepas de ratón, vivienda ambiente y dieta, optimización de la duración de administración y concentración de DSS en un experimento piloto es particularmente importante. Al ajustar estos factores, este método puede ser aplicado para evaluar ambos efectos anti y pro inflamatorias.
Introduction
Las dos formas principales de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (Cu) se caracterizan por remitente o progresivos inflamatorias crónicas del intestino con etiología multifactorial1,2 . El desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal depende de la genéticas, así como ciertos factores ambientales como dieta, uso de antibióticos y lo importante, infecciones patógenas. Sin embargo, la etiología y los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedad inflamatoria intestinal aún no están claros. Por lo tanto, numerosos modelos animales de EII químicamente inducidos han sido construidos y aplicado para delinear la patogenia y mecanismos y evaluar la efectividad de la terapéutica humana3.
Receptores del gusto son receptores acoplados a proteína G (GPCRs) y se clasifican en dos tipos principales: tipo I (T1Rs) y tipo II (T2Rs) que detectan compuestos amargos, dulce y umami. Gusto de cascadas de señales iniciadas por tastant proteínas de unión a T1Rs o T2Rs, activando el heterotriméricas G formado por α-gustducin y un dimer del Gβγ y conduce a la liberación de las subunidades Gβγ. La molécula Gβγ a su vez estimula el enzima efector corriente abajo del phospholipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 activada hidroliza el fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato en dos mensajeros secundarios intracelulares inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol] y IP3 se une a y abrir su canal-receptor IP3 R3, liberando iones de calcio desde el retículo endoplásmico. Esto eventualmente conduce a la apertura del canal del ion potencial transitorio del receptor Trpm5 y liberación del neurotransmisor ATP hacia los nervios gustativos4,5,6,7. Sin embargo, las vías de señalización de sabores salados y amargos son diferentes e independientes de dulce y umami gusto amargo8. Además, los componentes de sabor GPCRs y río abajo proteínas existen en varios tejidos extra orales. Estudios recientes indican eso α-gustducin, el principal componente del sabor de señalización, se encuentra expresada en la mucosa intestinal. Se necesitan estudios adicionales para entender las funciones de estos gusto señalización componentes en tejidos extra orales9,10.
El método aquí descrito se utiliza para caracterizar las funciones de las proteínas de señalización gustativas expresadas en tejidos extra orales. Combinamos una línea de ratón transgénico desarrollada para delinear cascadas de señales en papilas gustativas con el modelo de colitis inducida químicamente. En gran parte debido a su simplicidad procesal y similitudes patológicas humanas colitis ulcerosa, el dextrán sulfato de sodio (DSS)-modelo de enfermedad inflamatoria intestinal inducida ha sido más ampliamente utilizado entre la colitis inducida químicamente varios modelos11. En este estudio, utilizamos ratones deficientes en gustducin α como una línea representativa ratón para revelar nuevas funciones del α-gustducin inflamación e inmunidad mucosa intestinal 1) analizando los cambios morfológicos en el tejido y 2) análisis de diferencias en la expresión de citocinas relacionadas con inflamación en el colon. Este método puede ser utilizado determinar cuantitativa y cualitativamente los aportes de proteínas de señalización gustativas (y otras proteínas en el intestino) al daño tisular y la inflamación intestinal, cuando líneas de ratón modificado genéticamente por los genes de interés están disponibles. Ventajas de este método están permitiendo a los usuarios obtener datos integrados resultantes de acciones de la DSS química y deficiencia del gen de interés. Este método puede ser mejorado para aumentar su sensibilidad y revelar sutiles cambios intestinales a nivel celular y molecular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método puede ser empleado para posible determinar el efecto de mutaciones de genes específicos gustativas en la inflamación en un modelo murino de enfermedad inflamatoria intestinal inducida por DSS. Para aprovechar al máximo, la inducción óptima de la EII es un paso clave. El desarrollo de la colitis depende de varios factores, incluyendo la cepa de ratón, entorno de vivienda, microflora intestinal, así como los genes de interés. Se recomienda llevar a cabo un experimento piloto con un pequeño número de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por becas de la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81671016, 31471008 y 31661143030) y los institutos nacionales de salud (DC010012, DC015819) y por la Fundación Siyuan.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
Riferimenti
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