味觉信号蛋白废除对炎症性肠病小鼠肠道炎症的影响
Summary
在这里, 我们提出了一个方案, 以调查取消与阵风相关的基因对免疫反应的影响, 糊精硫酸钠 (dss) 诱导的炎症性肠病 (ibd) 小鼠模型。
Abstract
炎症性肠病 (ibd) 是一种与免疫有关的胃肠道疾病, 包括溃疡性结肠炎和克罗恩病, 影响着全世界数百万人的生活质量。ibd 症状包括腹痛、腹泻和直肠出血, 这可能是肠道微生物群、食物成分、肠道上皮细胞和免疫细胞相互作用造成的。评估肠道上皮和免疫细胞中表达的每个关键基因如何影响结肠炎症尤为重要。在肠道中发现了 g 蛋白偶联味觉受体, 包括 g 蛋白亚基α-gustducin 和其他信号蛋白。在这里, 我们以α-gustcducin 为代表, 描述了糊精硫酸钠 (dss) 诱导的 ibd 模型, 以评估味觉基因突变对肠道黏膜免疫和炎症的影响。该方法将基因敲除技术与化学诱导的 ibd 模型相结合, 可用于评估味觉基因失效的结果, 以及可能旺盛或抑制 dss 诱导的结肠免疫反应的其他基因。突变体小鼠在一定时期内使用 dss 进行监测和记录其体重、粪便和直肠出血。在给药过程中的不同时间点, 对一些小鼠进行安乐死, 然后测量其脾脏和结肠的大小和重量, 收集和处理肠道组织, 进行组织学和基因表达分析。数据显示, α-胃动素敲除导致过度减肥, 腹泻,肠道出血, 组织损伤, 和炎症相比, 野生类型的小鼠。由于诱导炎症的严重程度受小鼠菌株、居住环境和饮食的影响, 在试点实验中优化 dss 浓度和给药时间尤为重要。通过调整这些因素, 这种方法可以用来评估抗炎和促炎作用。
Introduction
炎症性肠病 (ibd)、克罗恩病 (cd) 和溃疡性结肠炎 (uc) 的两种主要形式的特点是慢性缓解或肠道进行性炎症的情况, 有多种因素的病因1,2.ibd 的发展取决于遗传以及某些环境因素, 如饮食、抗生素的使用, 以及重要的是致病性感染。然而, ibd 背后的病因和调控分子机制尚不清楚。因此, 许多化学诱导的 ibd 动物模型已经构建并应用, 以界定其发病机制和调节机制,并评估人类疗法的有效性3。
味觉受体是 g 蛋白偶联受体 (gpcr), 分为两种主要类型: i 型 (T1Rs) 和 ii 型 (T2Rs), 检测甜味、乌马米和苦味化合物。味觉信号级联是由味觉与 T1Rs 或 T2Rs 结合而开始的, 激活由α-gustpinin 和 gβγ二聚体组成的异位 g 蛋白, 并导致 gβ-γ亚基的释放。gβγ基团反过来刺激下游效应酶磷脂酶 c-β2 (plc-β2)。激活 plc-β2然后水解磷脂-4, 5-双磷酸酯水解成两个细胞内的次生信使 [肌醇-1, 4, 5-三磷酸 (ip 3) 和二酰基甘油], ip3结合并打开其通道受体 ip 3r3, 从内质网释放钙离子。这最终导致瞬态受体电位离子通道 trpm5 的开放和神经递质 atp 释放到味觉神经 4,5,6, 7.然而, 咸味和酸味的信号通路是不同的, 独立于甜味、乌米和苦味.此外, 味觉 gpcr 和下游蛋白的成分存在于各种口腔外组织中。最近的研究表明, α-gustducin, 味觉信号的主要组成部分, 被发现在肠道黏膜表达。需要进一步的研究来了解这些味觉信号成分在口腔外组织9,10的功能。
这里描述的方法是用来描述在口腔外组织中表达的味觉信号蛋白的功能。我们结合了转基因小鼠线开发的划定信号级联在味蕾与化学诱导的结肠炎模型。主要由于其程序简单和病理相似的人溃疡性结肠炎, 右旋糖酐硫酸钠 (dss) 诱导 ibd 模型已被最广泛地应用于各种化学诱导的结肠炎模型11。在这项研究中, 我们使用α-gustp型缺乏小鼠作为一个典型的小鼠行, 通过 1) 分析组织的形态变化和 2) 分析在表达的差异, 揭示α-gust糊涂 in 在肠道黏膜免疫和炎症中的新功能。与结肠炎症有关的细胞因子。这种方法可以用来定量和定性地确定味觉信号蛋白 (和其他蛋白质在肠道中表达) 对组织损伤和肠道炎症的贡献, 当转基因小鼠线的基因利息是可用的。这种方法的优点是使用户能够获得化学 dss 和感兴趣基因缺乏的作用所产生的综合数据。这种方法可以进一步改进, 以提高其敏感性, 并揭示在细胞和分子水平的微妙肠道变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方法可用于定量测定特定味觉基因突变对 dss 诱导的 ibd 小鼠模型炎症的影响。要充分利用 ibd, 最佳的 ibd 归纳是关键的一步。结肠炎的发展受多种因素的影响, 包括小鼠菌株、居住环境、肠道菌群以及感兴趣的基因。建议对少数小鼠进行试点实验, 以测试 dss 给药的不同剂量和持续时间。在试点实验中, 体重减轻、腹泻、肠道出血等严重症状, 以及组织损伤、免疫细胞浸润相关炎症、细胞因子表达…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金会 (81671016、31471008、3161613030) 和国家卫生研究院 (dc010012、dc015819) 和四元基金会的资助。
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
Riferimenti
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
