Auswirkungen des Geschmacks Signalisierung Protein Abschaffung auf Darm-Entzündung in eine entzündliche Darm-Krankheit-Maus-Modell
Summary
Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll zur Untersuchung der Wirkung von der Aufhebung der Verkos-Genen auf Immunreaktionen eine Dextran Sulfat Natrium (DSS)-induzierte entzündliche Darm-Krankheit (IBD)-Maus-Modell.
Abstract
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (IBD) gehört zu den immunvermittelte Magen-Darm-Störungen, einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, die die Lebensqualität von Millionen von Menschen weltweit betrifft. IBD Symptome sind Bauchschmerzen, Durchfall und rektale Blutungen, die sich aus den Wechselwirkungen zwischen Darm Microbiota, Nahrungsbestandteile, intestinale Epithelzellen und Immunzellen. Es ist von besonderer Bedeutung zu beurteilen, wie jeder Schlüssel-Gen in intestinalen epithelialen und Immun-Zellen exprimiert Entzündung im Dickdarm betrifft. G-Protein-gekoppelten Geschmacksrezeptoren, einschließlich G-Protein-Untereinheit α-Gustducin und andere Signalproteine wurden im Darm gefunden. Hier verwenden wir α-Gustducin als Vertreter und beschreiben eine Dextran Sulfat Sodium (DSS)-induzierte IBD-Modell zur Bewertung der Wirkung der gustatorischen Genmutationen auf Darm-Schleimhaut-Immunität und Entzündungen. Diese Methode verbindet gen Ko-Technologie mit dem chemisch induzierten IBD-Modell und kann so angewendet werden, um das Ergebnis der gustatorischen gen Aufhebung sowie andere Gene, die exuberate oder dämpfen die DSS-induzierte Immunantwort im Dickdarm zu beurteilen. Mutierte Mäuse sind mit DSS für einen bestimmten Zeitraum verabreicht, während, die Körpergewicht, Hocker und rektale Blutungen überwacht und aufgezeichnet werden. An verschiedenen Zeitpunkten während der Verabreichung, einige Mäuse eingeschläfert werden, dann die Maße und Gewichte der Milz und Doppelpunkte werden gemessen und Darm Gewebe werden gesammelt und bearbeitet für histologische und Genexpressionsanalysen. Die Daten zeigen, dass die α-Gustducin Ko-Ergebnisse in übermäßiger Gewichtsverlust, Durchfall, Darmblutungen, Gewebeschäden und Entzündungen vs. Wildtyp Mäusen. Da die Schwere der induzierten Entzündung durch Mausstämme, Häuslichkeit und Ernährung beeinflusst wird, ist die Optimierung der DSS Konzentration und Verwaltung Dauer in einem Pilotversuch besonders wichtig. Durch die Anpassung dieser Faktors, kann diese Methode angewendet werden, um beide Anti – und Pro-inflammatorische Effekte zu beurteilen.
Introduction
Die zwei Hauptformen von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) zeichnen sich durch chronische remittent oder progredient entzündlichen Erkrankungen des Darms mit multifaktoriellen Ätiologie1,2 . Die Entwicklung der IBD hängt von genetischen als auch bestimmte Umweltfaktoren wie Ernährung, Einsatz von Antibiotika, und allem pathogenen Infektionen. Die Ätiologie und molekularen Regulationsmechanismen, die zugrunde liegenden IBD sind jedoch noch unklar. Daher wurden zahlreiche chemisch induzierte IBD-Tiermodellen aufgebaut und angewendet, um abzugrenzen, die Pathogenese und Regulationsmechanismen und die Wirksamkeit der menschlichen Therapeutika3.
Geschmacksrezeptoren sind G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und sind als zwei Haupttypen klassifiziert: Typ I (T1Rs) und Typ II (T2Rs), die süß, Umami und Bitterstoffe erkennen. Geschmack Signalisierung Kaskaden sind initiierten tastant Bindung an T1Rs oder T2Rs, Aktivierung der Heterotrimeric G-Proteine, bestehend aus α-Gustducin und ein Gβγ-Dimer und führt zur Freisetzung von Gβγ-Untereinheiten. Die Gβγ glyko-stimuliert wiederum die nachgeschaltete Effektor Enzym Phospholipase C-β2 (PLC-β2). Aktivierte PLC-β2 dann hydrolysiert Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate in zwei intrazellulären sekundären boten [Inositol-1,4,5-Trisphosphate (IP3) und Diacylglycerol] und IP-3 bindet an und öffnen Sie die Kanal-Rezeptor-IP3 R3, Freigabe von Calcium-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum. Dies führt schließlich zu der Eröffnung des Transienten Rezeptor potenzielle Ionenkanal Trpm5 und Freisetzung der Neurotransmitter ATP auf die geschmackliche Nerven4,5,6,7. Die Signalwege der salzig und sauer Geschmack sind jedoch verschiedene, voneinander unabhängige aus süß, Umami und bitter schmeckt8. Darüber hinaus gibt es die Komponenten des Geschmacks GPCRs und nachgeschalteten Proteinen in verschiedenen extraoralen Geweben. Jüngste Studien gezeigt, dass α-Gustducin, die wichtigste Komponente der Geschmack Signalisierung, findet sich in der Darmschleimhaut ausgedrückt werden. Weitere Studien sind notwendig, um die Funktionen dieser Komponenten im extraoralen Gewebe9,10-Signalisierung Geschmack zu verstehen.
Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um Funktionen der gustatorischen Signalproteine in extraoralen Geweben ausgedrückt zu charakterisieren. Wir kombinieren eine transgene Mauslinie für die Abgrenzung der Signalisierung Kaskaden in Geschmacksknospen mit chemisch induzierten Kolitis-Modell entwickelt. Weitgehend wegen seiner prozessualen Einfachheit und pathologischen Ähnlichkeiten zum menschlichen Colitis ulcerosa, die Dextran Sulfat Natrium (DSS)-induzierte IBD-Modell wird am häufigsten unter den verschiedenen chemisch induzierten Kolitis Modelle11. In dieser Studie haben wir α-Gustducin-defizienten Mäusen als eine repräsentative Mauslinie um neuartige Funktionen von α-Gustducin Darm-Schleimhaut-Immunität und Entzündungen zu enthüllen, indem er (1) Analyse der morphologische Veränderungen im Gewebe und (2) prüfen Unterschiede in der Expression von Zytokine, die im Zusammenhang mit Entzündungen im Dickdarm. Diese Methode lässt sich quantitativ und qualitativ die Beiträge der gustatorischen Signalproteine (und andere Proteine im Darm) bestimmen zu Gewebeschäden und Darmentzündungen, wenn gentechnisch veränderte Maus für die Gene der Linien Interesse stehen zur Verfügung. Vorteile dieser Methode ermöglichen es Benutzern, integrierte Daten, die aus Handlungen der chemischen DSS und Mangel an das gen des Interesses zu erhalten. Diese Methode kann weiter verbessert werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und feine Darm Veränderungen auf zellulärer und molekularer Ebene zu offenbaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode kann eingesetzt werden, um quantitativ bestimmen die Wirkung von Mutationen bestimmter Gene geschmackliche auf Entzündung in einem Mausmodell der DSS-induzierte IBD. Um alle Vorteile nutzen, ist optimale Induktion von IBD ein wichtiger Schritt. Die Entwicklung des ulcerosa ist von mehreren Faktoren ab, einschließlich Maus Stamm, Häuslichkeit, Darmflora, sowie die Gene von Interesse beeinträchtigt. Es wird empfohlen, einen Pilotversuch mit eine kleine Anzahl von Mäusen testen Sie verschiedene Dosierunge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 und 31661143030) und die National Institutes of Health (DC010012, DC015819) und die Siyuan Stiftung unterstützt.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
Riferimenti
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