Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning
Summary
Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.
Abstract
Histoloji ve immünhistokimya mikroskopik anatomi görselleştirmek ve proteinlerin biyolojik doku içinde yerelleştirmek için analiz rutin yöntemleri vardır. Neuroscience, yanı sıra diğer bilimsel alanları bir bolluk, bu teknikleri kullanılır. İmmünhistokimya slayt monte doku veya serbest yüzer bölümleri üzerinde yapılabilir. Slayt monte numune hazırlama bir zaman yoğun bir süreçtir. Aşağıdaki protokol için Megabrain adında bir teknik cryosection ve mount beyin dokusu tek bir donmuş blok birden çok beyin birleştirerek 90 %’e kadar geçen süre azalır. Ayrıca, bu teknik turda büyük bir histochemical çalışma boyama arasında görülen değişkenliği azaltmak. Geçerli teknik kemirgen beyin dokusu içinde aşağı akım immunohistokimyasal analizleri kullanarak için optimize edilmiş; Ancak, cryosectioning kullanan farklı bilimsel alanlar için uygulanabilir.
Introduction
Burada, iletişim kuralı için birden çok kemirgen aynı anda aşağı akım immunohistokimyasal yordamlar için beyin cryosection için geliştirilen Megabrain dediğimiz bir roman yöntemi mevcut. Tek slaytları içeren birden fazla hayvan dokudan üretimi için bir Megabrain sağlar. Bu teknik, aynı anda 9 yetişkin fare hemisferlerin veya 5 Yetişkin tam beyin, koronal bölümleri kesmek için en iyi duruma getirilmiş. Bu nedenle, en büyük immunohistokimyasal çalışmalar veya slayt monte beyin dokusu üzerinde hayvan büyük bir kohort yapılan diğer analizler uygulanabilir bir tekniktir.
İmmünhistokimya belirli antikor protein anlamak ve kendi ifade ve hücresel değişiklikler belirli doku1,2,3‘ te karakterize ilgi karşı kullanımını gerektirir. İmmünhistokimya kullanımı nörolojik araştırma, beyin4hücresel ve moleküler anlamada yardım diğer bilimsel disiplinler arasında yaygındır. Büyük ölçekli çalışmalar birçok hayvan ve beyin bölümleri içeren kaynak ve zaman yoğun olabilir. Bu nedenle, Megabrain gelişimi çok yönlü bir mantığı var: süresini azaltmak için montaj ve sonuç olarak daha az reaktifler kullanırken doku, boyama cryosectioning geçirdim. Ayrıca, yeteneği süreci hızlandırmaya ve aynı birden çok beyin leke yuvarlak bazı parçalar, bir sınırlama immünhistokimya3boyama arasında değişkenlik hafifletmeye yardımcı olur. Buna ek olarak, bir Megabrain kesit bireysel donmuş kemirgen beyin kesit için alternatif bir zaman tasarrufu ve doku hayvanlar veya bile tedavi grupları arasında hızlı karşılaştırma mikroskobu teknikleri tarafından sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Megabrain ve çevresi sıcaklığı sürekli çözdürme ve doku yeniden donma önlemek için takip gerekir Bu yordam sırasında düşünülmelidir. Beyin sadece-20 ° C dondurucudan için 3 kez olarak bu değindi ‘s ve daha sıcak bir dalgalanan sıcaklık, doku cryostat sol Tammy’nin ve refreezes, bir jöle gibi doku ve anormal doku bütünlüğü10neden her zaman kaldırılabilir. Bu nedenle, Megabrain tek seferde kesmek için en iyi yöntemdir.
Doku fiksasyon ve cr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH misyon destek fonları bu el yazması bildirilen araştırma desteklenen. Yazarlar Daniel Griffiths rakamlar kullanılan fotoğraf çekmek teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
Riferimenti
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
