Summary

Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Published: September 18, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.

Abstract

L’histologie et l’immunohistochimie sont des méthodes de routine d’analyse afin de visualiser l’anatomie microscopique et de localiser des protéines dans les tissus biologiques. En neurosciences, comme une pléthore d’autres domaines scientifiques, ces techniques sont utilisées. Immunohistochemistry peut être fait sur le tissu de diapositives montées ou sections flottantes. Préparation des échantillons montés sur glissière est un processus intensif de temps. Le protocole suivant pour une technique, appelée le Megabrain, réduit le temps nécessaire aux tissus du cerveau cryosection et Mont jusqu’à 90 % en combinant plusieurs cerveaux en un seul bloc congelé. En outre, cette technique réduit la variabilité observée entre tours, dans une vaste étude histochimique de coloration. La technique actuelle a été optimisée pour l’utilisation de tissus cérébraux de rongeurs dans les analyses immunohistochimique en aval ; Toutefois, il peut être appliqué à différents champs scientifiques qui utilisent cryosectioning.

Introduction

Nous présentons ici le protocole pour une nouvelle méthode, que nous appelons Megabrain, mis au point pour cryosection plusieurs rongeurs brains simultanément de méthodes immunohistochimiques en aval. Un Megabrain permet la production de diapositives individuelles contenant des tissus de plusieurs animaux. Cette technique a été optimisée pour des coupes coronales de 9 hémisphères de rat adulte ou 5 adultes cerveau complet, en même temps. Par conséquent, cette technique est plus applicable dans les études immunohistochimiques grand ou autres analyses effectuées sur les tissus cérébraux monté sur glissière d’une importante cohorte d’animaux.

Immunohistochemistry implique l’utilisation d’anticorps spécifiques dirigés contre les protéines d’intérêt de comprendre et de caractériser leur expression et les changements cellulaires dans des tissus spécifiques1,2,3. L’utilisation de l’immunohistochimie est répandue dans la recherche en neurosciences, entre autres disciplines scientifiques, en aidant à la compréhension moléculaire et cellulaire du cerveau4. Des études à grande échelle impliquant de nombreux animaux et sections du cerveau peuvent être les ressources et le temps intensif. Par conséquent, il y a une justification aux multiples facettes du développement de la Megabrain : pour réduire le temps passé à cryosectioning, de montage et de coloration des tissus, lors de l’utilisation par conséquent moins réactifs. En outre, la possibilité de rationaliser le processus et tacher les cerveaux multiples dans le même tour contribue à alléger la variabilité entre les lots, une limitation de l’immunohistochimie3de coloration. En outre, un Megabrain de sectionnement est une alternative de gain de temps au sectionnement des cerveaux de rongeurs congelés individuels et permet une comparaison rapide des tissus entre animaux ou même des groupes de traitement par des techniques de microscopie.

Protocol

La technique de Megabrain a été optimisée à l’aide de cerveaux ensemble et hemisected de mâles adultes du souris C57Bl65et jeunes rats Sprague-Dawley rats Sprague-Dawley adultes qui ont été perfusé avec 1 x une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de transcardially par 4 % de paraformaldéhyde6. Des résultats similaires pouvant être effectuées dans les autres souches de souris et de rats, chez les deux sexes et à des âges différents. L’étu…

Representative Results

Un résultat positif à cette procédure est le tissu qui se trouve à plat sur la diapositive, sans bulles ni les larmes, dans le sens où ils ont été gelés. Des sections de tissu sont équidistants apart et facilement identifiable en raison du bon placement du cerveau dans l’OPO et bonne notation tel que démontré dans la Figure 1. En supposant que le tissu cérébral ont été recueilli auprès des animaux du même âge, et que le tissu a été corre…

Discussion

Il devrait être considéré au cours de cette procédure que la température de la Megabrain et ses environs doit être constamment surveillée pour éviter la décongélation et la recongélation des tissus. Le cerveau seulement s’éliminent du congélateur-20 ° C vers le haut à 3 fois comme chaque fois qu’il est touché et gauche dans le cryostat, avec une température plus chaude fluctuant, le tissu dégèle et regèle, causant une gelée comme texture et tissu anormal intégrité10. Par…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fonds de soutien de Mission PCH appuyé la recherche signalée dans ce manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier Daniel Griffiths pour prendre les images utilisées dans les chiffres.

Materials

Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) Fisher Scientific 14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Fisher Scientific 18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-128
Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap Fisher Scientific 03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg Fisher Scientific S2-212 Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical Fisher Scientific O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers Fisher Scientific 02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) Fisher Scientific 13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q
STANLEY Razor Blade Grainger 4A807
Edge-Rite Microtome blades Fisher Scientific 14-070-60
Microscope slides (1" frost) – white Fisher Scientific 22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 Fisher Scientific 70-013-032 Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes Amazon B079J12ZRV
PAP pen abcam ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. Electron Microscopy Sciences EMS065

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Green, T. R., Ortiz, J. B., Harrison, J. L., Lifshitz, J., Rowe, R. K. Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains. J. Vis. Exp. (139), e58513, doi:10.3791/58513 (2018).

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