Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzufrieren und Abschnitt Gehirngewebe von mehreren Tieren als eine zeitsparende Alternative zur Bearbeitung einzelner Gehirne. Dies senkt die Färbung Variabilität bei Immunohistochemistry und reduziert Zeit Kryoschneiden und Imaging.
Abstract
Histologie und Immunhistochemie sind Routineverfahren der Analyse zu visualisieren mikroskopische Anatomie und Proteine in biologischen Geweben zu lokalisieren. In Neurowissenschaften, sowie eine Fülle von anderen wissenschaftlichen Bereichen sind diese Techniken verwendet. Immunohistochemistry kann auf Schlitten montiert Gewebe- oder frei schwebenden Abschnitte erfolgen. Probenvorbereitung von Folie montiert, ist eine zeitintensive Prozess. Das folgende Protokoll für eine Technik, genannt die Megabrain reduziert den Zeitaufwand für Cryosection und Mount Hirngewebe um bis zu 90 % durch die Kombination mehrerer Gehirne in einem gefrorenen Block. Darüber hinaus reduziert diese Technik Variabilität zwischen runden, in einer großen Studie histochemische Färbung gesehen. Die aktuelle Technik wurde optimiert für die Verwendung von Nagetier Hirngewebe in nachgeschalteten immunhistochemische Analysen; jedoch kann es zu verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen angewendet werden, die Kryoschneiden verwenden.
Introduction
Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für eine neuartige Methode, die wir Megabrain nennen, zu Cryosection mehrere Nagetier gleichzeitig für nachgeschaltete immunhistochemische Verfahren Gehirne entwickelt. Ein Megabrain ermöglicht die Herstellung der einzelnen Folien mit Gewebe aus mehreren Tieren. Diese Technik wurde optimiert, um koronalen Abschnitte aus 9 Erwachsene Ratte Hemisphären oder 5 Erwachsene voller Gehirne gleichzeitig geschnitten. Daher ist die Technik am ehesten zutreffenden in großen immunhistochemische Studien oder andere Analysen auf Schlitten montiert Hirngewebe aus einer großen Kohorte von Tieren gemacht.
Immunohistochemistry beinhaltet die Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen Proteine des Interesses zu verstehen und zu charakterisieren ihren Ausdruck und zelluläre Veränderungen in bestimmten Gewebe1,2,3. Die Verwendung von Immunohistochemistry ist in der neurowissenschaftlichen Forschung, unter anderen wissenschaftlichen Disziplinen, Beihilfe bei der zellulären und molekularen Verständnis des Gehirns4verbreitet. Groß angelegte Studien, an denen viele Tiere und Gehirn Abschnitte können Ressourcen- und zeitintensiv sein. Als solche gibt es eine vielfältige Beweggründe für die Entwicklung der Megabrain: Verkürzung verbrachte Kryoschneiden, Montage und Färbung Gewebe, wobei folglich weniger Reagenzien. Darüber hinaus die Möglichkeit, den Prozess zu optimieren und Flecken auf mehrere Köpfe in der gleichen Runde hilft, einige der Variabilität zwischen Chargen, eine Beschränkung von Immunohistochemistry3Färbung zu lindern. Darüber hinaus ein Megabrain-Schnitt ist eine zeitsparende Alternative zum Schneiden einzelne gefrorene Nager Gehirne und ermöglicht schnellen Vergleich der Gewebe zwischen Tieren oder sogar Behandlungsgruppen durch mikroskopiertechniken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während dieses Vorgangs zu berücksichtigen, dass die Temperatur der Megabrain und seine Umgebung ständig überwacht werden muss, um zu verhindern, Auftauen und wieder einfrieren des Gewebes. Das Gehirn kann nur aus dem Tiefkühler-20 ° C bis zu 3 mal als entfernt werden jedes Mal, wenn es berührt wird und Links in den Kryostaten mit wärmeren schwankende Temperaturen, das Gewebe auftaut und gefriert, wodurch eine Gelee wie Textur und krankhaftes Gewebe Integrität10. Daher ist es optimal, um …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH Mission Fördermittel unterstützt die Forschung in diesem Manuskript berichtet. Die Autoren möchte Daniel Griffiths danken für die Aufnahme der Bilder, die in den Figuren verwendet.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
Riferimenti
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