Här presenterar vi ett protokoll för kännetecknar monocyt delmängder av helblod flödescytometri. Detta inkluderar beskriver hur gate delmängder och bedöma deras uttryck för yta markörer och ger ett exempel på bedömningen av uttrycket av M1 (inflammatorisk) och M2 markörer (antiinflammatoriska).
Monocyter är nyckelpersoner i olika inflammatoriska sjukdomar och ändringar till dessa celler, inklusive deras delmängd proportioner och funktioner, kan ha patologiska betydelse. En idealisk metod för att undersöka förändringar av monocyter är helblod flödescytometri som minimal hantering av prover av denna metod begränsar artefaktiska cellaktivering. Dock tas många olika metoder till gate monocyt delmängder vilket leder till inkonsekvent identifiering av delmängder mellan studier. Här visar vi en metod där helblod flödescytometri att identifiera och karakterisera mänskliga monocyt undergrupper (klassisk, mellanliggande och icke-klassisk). Vi beskriver hur man förbereda blodprov för flödescytometri, gate delmängder (säkerställa kontaminerande celler har tagits bort) och avgöra monocyt delmängd uttryck för yta markörer – i detta exempel M1 och M2 markörer. Detta protokoll kan utvidgas till andra studier som kräver en Usenets standardmetod för att bedöma monocyt delmängd proportioner och monocyt delmängd uttryck för andra funktionella markörer.
Monocyter är en typ av vita blodkroppar som spelar en viktig roll i att främja och lösa inflammation. Det finns tre huvudsakliga grupper av monocyter erkända, Klassiskt (~ 85%), intermediär (~ 5%) och icke-klassisk (~ 10%) monocyter, som karakteriseras av deras nivå av kluster av differentiering (CD) 14 och CD16 uttrycket1. Proportionerna av monocyt undergrupper kan skilja sig med förekomsten av sjukdom, till exempel en ökad andel av intermediärer i olika inflammatoriska stater2,3 , inklusive kardiovaskulär sjukdom, där av intermediärer är associerade med kliniska händelser4,5. Dessutom i sjukdomstillstånd, kan monocyter också genomgå funktionella förändringar, med många förändringar upptäckas av en skillnad i ytan markör uttryck6,7. Ett sådant exempel är monocyt M1-skevning, en ökning av markörer associerade med M1 makrofager, som har observerats i hjärt-kärlsjukdom, diabetes, fetma och metabolt syndrom7,8,9 , 10.
Trots populariteten av flödescytometri att bedöma monocyt delmängd andel och funktion, finns det en betydande variation i provberedning och delmängd gating mellan studier vilket gör det svårt att jämföra resultaten mellan sådana studier. Ännu viktigare, det finns ingen konsensus i avgränsningen av monocyt delmängder, men en standardiserad metod är viktigt med tanke på den kliniska betydelsen av förändringar i delmängd proportioner i flera sjukdomar. En del av svårigheten att gating härrör från det faktum att monocyter skilja från den klassiska genom mellanliggande till den icke-klassiska delmängd11 och som sådan, monocyter existerar som ett kontinuerligt spektrum snarare än distinkta populationer12 . Intressant, visade Zawada et al. att använda antingen en rektangulär eller trapetsoid gating av mellanliggande delmängden, båda resulterade i en högre mellanliggande delmängd som förutspådde en kardiovaskulär endpoint13. Detta belyser att, åtminstone för beräkning av proportioner, nyckelfrågan tillämpning av en konsekvent Usenets strategi mellan olika prover (och studier), snarare än att försöka slutgiltigt diskriminera delmängder. Slutgiltiga gating kan vara viktigare vid bedömning av funktion, förändringen i markör uttryck mellan undergrupper är inkrementella12,14, och thus igen, konsekvens i gating är kanske nyckel. Som sådan, som ett mål som gating metod som reproducibly apportions monocyt delmängder mellan olika prover behövs. Syftet med den metod som presenteras här är att gate monocyt undergrupper med en tydlig förklaring och motivering till Usenets tekniken sysselsatt och bedöma delmängder för surface markör uttryck, vilket ger en metod som tillåter forskare att ha förtroende för användningen av denna teknik när man bedömer olika prover.
Helblod flödescytometri är en idealisk metod för att studera monocyter som cellerna undersöks i förhållanden nära deras fysiologiska närmiljön som ger en inblick i deras roller i infektion och inflammatoriska tillstånd. Dessutom, användning av färska (dvs, obearbetade) blodprov minimerar de ändringar eller cell omvandlingar som kan uppstå på grund av lagring eller hantering18,19, såsom de rapporterats med freeze-tinade monocyter 20. snabb provberedning rekommenderas eftersom vissa markörer är uppreglerad om proverna förvaras vid rumstemperatur före bearbetning19. Den optimala koncentrationen av M1 och M2 markörer bestämdes genom titrering, och detta bör göras för eventuella nya antikropp att begränsa icke-specifik bindning samtidigt att graden av Skift är på grund av antigen uttryck och inte begränsas av brist på antikroppar. Borttagning av röda blodkroppar och fixering av vita blodkroppar med Lys lösning är ett viktigt steg i detta protokoll som förekomst av röda blodkroppar kan störa flödet flödescytometri21,22. Observera att medan vissa lysis är kompatibla med no-tvätta färgning, tydligare populationer är tydligt i våra händer när en TVÄTTNINGSSTEGET används.
Rätt inställning av en flödescytometer är också kritisk när man jämför uttryck av monocyt markörer. Vi rekommenderar att forskare upprätthålla konsekventa mål fluorescens intensiteter av kontroll pärlor och utföra kvalitetskontroll på instrumentet skall användas till att ge konsekventa resultat över olika prover kör på olika dagar. Utöver detta används isotypen kontroller att bistå i tolkningen av någon icke-specifik bakgrund signal genereras av icke-specifik antikropp bindande. Monocyter har höga nivåer av Fc-receptorer11 och är därför benägna att icke-specifik bindning. Notera, nivån på icke-specifik bindning skiljer sig för de olika undergrupper, och därmed användningen av en isotypen kontroll blir viktigt när man jämför graden av markör uttryck mellan undergrupper.
Ett annat viktigt kriterium anses är Usenets stegen anställd. Vissa studier tyder på att det är avgörande för att rita en tight grind runt monocyt befolkningen i FSC(A)/SSC(A) komplott för att bli av med de flesta av de icke-monocytic CD16 positiva celler23,24,25, men detta kan leda till förlust av några monocyter som icke-monocyt celler kan överlappa med monocyter på FSC/SSC tomter26. Snarare för att utesluta alla andra blodkroppar som kan förorena monocyter, är införandet av en tredje monocyt markör förutom CD14 och CD16, väsentliga26,27. Av denna anledning, HLA-DR används ofta och är idealiskt eftersom det inte är uttryckt av NK celler eller neutrofiler17,28. Även lymfocyter (B-celler och T-celler) kan uttrycka HLA-DR, de skiljer sig från monocyter i respekt till CD14 uttryck. HLA-DR är en idealisk tredje markör, CD86 har också rekommenderat5,27,29 men användes inte här eftersom det är också en M1 markör och därmed dess grad av uttryck på monocyt undergrupper bedömdes.
Validering av den portande strategi som används är av avgörande betydelse. NK-celler är kända att överlappa med icke-classicals om de inte är gated ut28, märker vi att B-celler också kan överlappa med den icke-classicals (figur 2B); om detta är fallet i andra studier kan bero på fluorokrom valet, instrumentet konfiguration, detektorkänslighet eller ens de sjukdomstillstånd som undersöks. Här, på överlappande B cells visade högt uttryck av HLA-DR och var inte gated ut genom val av HLA-DR positiva celler i figur 1 d. Snarare att ta bort B-celler vi använde en ytterligare tomt CD14 / HLA-DR, där B-celler skilja från icke-classicals på grund av deras högre HLA-DR och låg CD14 uttryck.
Det finns också många olika sätt som utfärda utegångsförbud för av monocyter själva har dragits i litteraturen; Dessa inkluderar kvadranter (delmängder skiljs åt av kvadrant markörer) och rektangulära eller trapetsoid lådor13 (med separata lådor dras för varje delmängd) som dessutom skiljer sig i deras placering som avgränsar där en delmängd slutar och en annan börjar. Dessa skillnader sannolikt återspeglar det faktum att monocyter existerar som ett kontinuum av celler, att skilja från klassiskt till icke-klassiska, snarare än klart skilda populationer. Men eftersom variationer i tekniker för att identifiera delmängder själva kan leda till skillnader i de beräkna monocyt delmängd proportionerna, blir det viktigt att metoden Usenets är någorlunda objektiva, snarare än subjektiva, som detta kommer att göra metoden mer robust och reproducerbara. Vissa studier använder en isotypen kontroll för CD16 för att bestämma gränsen mellan klassiskt och mellanliggande delmängder30. Däremot, om du vill definiera separationen mellan intermediärer och icke-classicals, har det föreslagits att gränsens kan vara lodrät eller sned, med valet upp till utredarna, förbehållet att det ska vara reproducerbara, men en rektangulär grind har rekommenderats för att underlätta jämförelser mellan studier13,30,31. Här, erhölls ökad objektivitet genom att plotta data på en zebra tomt och tillämpa objektiva visuella regler, eftersom zebra tomter ger en ytterligare visualisering cue genom att blanda färgövertoning till varje lika sannolikhet bin över en traditionell kontur tomt. Den högra kanten av den klassiska delmängden drogs så att befolkningen var jämnt fördelade runt befolkningen medianen. Uppdelningen mellan intermediärer och icke-classicals standardiserades också genom att ha basen av intermediärer justera med botten av de koncentriska cirklarna inom klassisk befolkningen (dvs. mellanliggande befolkningen tydligt uttrycker höga nivåer av CD14, enligt Standardnomenklatur1).
Medan vissa studier har föreslagit användning av ytterligare markörer, såsom C-C chemokine receptorn typ 2 (CCR2) eller 6-sulfo LacNAc (SLAN) för att få framgångsrika uppräkning av monocyter och avslöja deras kliniska betydelse32,33 , i våra händer uttryck för många monocyt funktionella markörer varierar kraftigt mellan individer14. Sådan variation kan begränsa användbarheten av dessa markörer att definiera grupper baserat på deras uttryck. Automatiserad beräkningsvetenskapliga metoder har också använts för att visualisera och kluster monocyt delmängder inklusive visuella interaktiva stokastiska granne inbäddning (viSNE), t-fördelad stokastisk granne inbäddning (tSNE) eller Spanning-tree Progression Analys av densitet-normaliserade händelser (SPADE)34,35, som kan ge visuell representation av cellerna utifrån uppsättningen flera markörer används. Medan detta har visat sig öka noggrannheten för Usenets strategin i monocyt delmängd klassificering, är det känt att en nackdel är antalet antikroppar (och motsvarande fluorophore kanaler) krävs. Dess användbarhet beror på de frågor som ställs; den extra komplexiteten kan inte vara motiverat, exempelvis i uppräkning studier.
Monocyter gated med vår teknik visar proportioner i linje med litteraturen och uttrycket av yta markörer av tre delmängder lätt kan fastställas. Sammantaget ger den teknik och metodik som beskrivs här en standardiserad och okomplicerad metod för uppräkning av monocyt delmängd proportioner och bedömningen av surface markör uttryck, som kan utökas till att omfatta andra markörer samt, därmed validera deras funktionella roller i olika andra villkor.
The authors have nothing to disclose.
Flödescytometri utfördes i den flöde flödescytometri Core Facility som stöds av Westmead Institutet för medicinsk forskning, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales, och nationella hälsa och medicinska forskningsrådet. Denna studie stöddes av klinisk kemi forskning och utbildningsfonden.
BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml | Becton Dickinson | 7128959 | |
Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |