JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologia e infezioni

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Published: October 17, 2018
doi:
10.3791/57941
, , , , ,
1Department of Surgery, Vascular Biology Research Centre,Westmead Hospital, 2Westmead Clinical School, Department of Surgery,The University of Sydney, 3Westmead Research Hub,Westmead Institute for Medical Research, 4Institute for Clinical Pathology and Medical Research,Westmead Hospital

Summary

Qui presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di sottoinsiemi del monocito mediante citometria di flusso di sangue intero. Ciò include che delinea come cancello i sottoinsiemi e valutare la loro espressione di marcatori di superficie e dando un esempio della valutazione dell’espressione di M1 (infiammatoria) e marcatori M2 (antinfiammatorio).

Abstract

I monociti sono contributori chiave in vari disordini infiammatori e alterazioni di queste cellule, tra cui loro sottoinsieme proporzioni e funzioni, possono avere significato patologico. Un metodo ideale per l’esame di alterazioni di monociti è cytometry di flusso di sangue intero, come la manipolazione minima dei campioni da questo metodo limita l’attivazione delle cellule artifactual. Tuttavia, molti approcci diversi sono prese per i sottoinsiemi del monocito portando a incoerente identificazione dei sottoinsiemi tra gli studi del cancello. Qui dimostriamo un metodo utilizzando sangue intero flusso cytometry per identificare e caratterizzare i sottoinsiemi di monociti umani (classiche, intermedi e non classica). Abbiamo illustrato come preparare i campioni di sangue per citometria a flusso, cancello i sottoinsiemi (verificare di aver rimosso cellule contaminanti) e determinare monocito sottoinsieme espressione di marcatori di superficie — in questo esempio M1 e M2 marcatori. Questo protocollo può essere esteso ad altri studi che richiedono un metodo di controllo standard per la valutazione del monocito sottoinsieme proporzioni ed espressione di sottoinsieme del monocito di altri marcatori funzionali.

Introduction

I monociti sono un tipo di globuli bianchi che svolgono un ruolo importante nella promozione e risoluzione di infiammazione. Ci sono tre principali sottoinsiemi di monociti riconosciuti, classici (~ 85%), intermedio (~ 5%) e non-classica monociti (~ 10%), che sono caratterizzati dal loro livello di cluster di differenziazione (CD) 14 e CD16 espressione1. Le proporzioni dei sottoinsiemi del monocito possono variare con la presenza della malattia, come una proporzione aumentata di intermedi in vari stati infiammatori2,3 tra cui malattie cardiovascolari, dove si trova il livello di sostanze intermedie associato a eventi clinici4,5. Inoltre, in condizioni di malattia, monociti possono anche subire cambiamenti funzionali, con molti cambiamenti rilevabili da una differenza di superficie dell’indicatore espressione6,7. Un esempio è monocito M1-inclinazione, un aumento in marcatori associati con i macrofagi M1, che è stato osservato nella malattia cardiovascolare, diabete, obesità e sindrome metabolica7,8,9 , 10.

Nonostante la popolarità di citometria a flusso per valutare la funzione e la proporzione di sottoinsieme del monocito, c’è una considerevole variabilità nella preparazione del campione e sottoinsieme gating tra gli studi che lo rende difficile confrontare i risultati tra tali studi. Cosa importante, non ci è consenso nella delimitazione dei sottoinsiemi del monocito, ancora un approccio standardizzato è essenziale dato il significato clinico dei cambiamenti nelle proporzioni di sottoinsieme in parecchie malattie. Parte della difficoltà di gating deriva dal fatto che i monociti differenziano dal classico attraverso l’intermedio al sottoinsieme non classici11 e come tale, monociti esistano come uno spettro continuo, piuttosto che popolazioni distinte12 . Interessante, Zawada et al hanno mostrato che utilizzando entrambi un rettangolare o trapezoidale gating del sottoinsieme intermedio, sia portato in un sottoinsieme di intermedio superiore che ha predetto un endpoint cardiovascolari13. Questo mette in evidenza che, almeno per calcolare le proporzioni, la questione chiave è l’applicazione di una coerenza strategia di gating tra diversi campioni (e studi), piuttosto che tentare di definitivamente discriminare tra sottoinsiemi. Mentre gating definitivo può essere più importante quando la valutazione della funzione, la variazione dell’espressione dei marker tra sottoinsiemi è incrementale12,14, e così ancora una volta, coerenza nel gating è forse chiave. Come tale, è necessario un obiettivo gating metodo che riproducibile distribuendole i sottoinsiemi del monocito tra diversi campioni. Lo scopo del metodo presentato qui è quello cancello sottoinsiemi del monocito con una chiara spiegazione e giustificazione per la tecnica di gating impiegato e valutare i sottoinsiemi dell’espressione dei marker di superficie, fornendo così un metodo che permette ai ricercatori di avere fiducia nell’uso di questa tecnica nella valutazione di campioni diversi.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal comitato di etica della ricerca umana WSLHD (HREC) (approvazione AU rosso HREC/15/WMEAD/289). 1. preparazione del campione per citometria a flusso di sangue intero Nota: Come il sangue umano è potenzialmente infettivo, la messa a punto del campione deve essere eseguita in una cappa biohazard. Raccogliere i campioni di sangue da parte dei partecipanti in provette da 3 mL etilene diammina tetra acido acetico (EDTA). Determinare il numero di globuli bianchi (WBC) utilizzando un analizzatore ematologico o un emocitometro. Diluire con tamponato fosfato salino (PBS) (pH ~ 7.4) per regolare la concentrazione di ~ 5 x 106 WBC/mL. Preparare il mix master sufficienti per il numero di provette (ad es., per 14 tubi, preparare mix master: 16x) combinando 16x volumi di 50 µ l di sangue, 0,75 µ l anti-CD14-V450, 0,5 µ l anti CD16-APC e 0,625 µ l anti HLA-DR-PerCP. Vortice e pipetta 51,9 µ l di mix in ciascuna provetta (tabella 1).Nota: Gli anticorpi dovrebbero essere titolati per determinare le concentrazioni di colorazione ottimale per gli anticorpi fluorescenti utilizzate. Aggiungi marcatore di superficie (M1 e M2 o isotipo controllo, ficoeritrina (PE) etichettato) anticorpi (esempio come da tabella 2) e PE etichettati marcatori per cellule di T (CD3), cellule di B (CD19), neutrofili (CD66b), e cellule natural killer (NK) (CD56) (tabella 3). Vortex e incubare per 30 min, 4 ° C al buio.Nota: I marcatori per i linfociti, i neutrofili e le cellule NK sono inclusi solo per la validazione del metodo gating. Aggiungere 250 µ l di soluzione fissaggio di combinato del globulo rosso Lisi/WBC, delicatamente immediatamente, vortex e incubare per 10 minuti al buio a 4 ° C. Aggiungere 250 µ l di PBS e spin cellule giù a 260 x g per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule a 300 µ l di 1% di formaldeide.Nota: La formaldeide è tossica. Utilizzare guanti in nitrile e in cappa. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce fino a quando l’analisi viene eseguita.Nota: L’analisi di flusso si raccomanda di essere fatto entro 48 h dalla preparazione del campione. 2. flusso Cytometry Verifica registro citometro a flusso per garantire il personale della struttura hanno effettuato i controlli di controllo di qualità.Nota: Per garantire la coerenza tra analisi, strumento di controllo di qualità e mantenere costante intensità di fluorescenza di destinazione utilizzando microsfere di controllo sono consigliate. Per impostare l’esperimento di citometria a flusso, fare clic su “nuovo esperimento poi”esemplare”e”nuovo tubo”per aggiungere i tubi. Selezionare bivariate grafici facendo clic sull’icona e utilizzare i menu a discesa per selezionare i parametri di asse. Garantire l’inclusione di un complotto di CD16/CD14 e una trama visualizzati da un rivelatore a fianco di tempo di monitorare l’acquisizione. Inserire il tubo e fare clic su “Acquire”. Controllare le impostazioni di tensione strumento garantendo che il rilevatore segnali non sono fuori scala. Osservare le cellule che cade nel cancello del monocito della trama CD14/CD16. Impostare la soglia di registrazione a 5.000 eventi per il cancello classico del monocito e cliccare su “Record”. Continuare a registrare i dati per provette rimanenti. Dopo dati per tutte le provette sono stati registrati, è possibile esportare i dati di flusso come file. FCS per l’analisi.Nota: Per garantire l’accuratezza, i controlli di compensazione di singolo colore dovrebbero essere registrati. Una matrice di incremento retributivo può essere calcolato e applicato ai dati prima dell’analisi per tenere conto di fuoriuscita spettrale oltre15,16. 3. monocito Gating Aprire i file nel software di analisi. Fare doppio clic su nome del filmato e selezione dei parametri dai menu a discesa per visualizzare le cellule su una area di forward scatter FSC (A) / dispersione altezza FSC(H) in avanti. Creare un cancello di esclusione del doppietto facendo clic sull’icona dello strumento del cancello di poligono e che racchiude le cellule come in (Figura 1A). Selezionare le celle con cancello (facendo doppio clic sulla regione con cancello) e sul display nuova casella regolare parametri del menu a discesa per visualizzare le celle su un FSC (A) / dispersione laterale SSC(A) plot. Fare clic sull’icona cancello rettangolare e generosamente selezionare la popolazione monocito basata sulle proprietà di dispersione avanti e laterali per escludere la maggior parte dei linfociti, cellule NK e granulociti (Figura 1B). Selezionare le celle con cancello e visualizzare nuovamente su un terreno di CD14/CD16, selezionando i parametri utilizzando i menu a discesa. Fare clic sul cancello poligono per selezionare monociti basati sulla loro forma caratteristica “┐” (Figura 1). Selezionare le celle con cancello e visualizzare i monociti su un terreno di CD16/HLA-DR utilizzando i menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul cancello poligono per selezionare le cellule positive di HLA-DR ed escludere qualsiasi restanti NK le cellule ed i neutrofili17 (Figura 1). Selezionare le celle con cancello e visualizzare le cellule positive di HLA-DR su un terreno di CD14/HLA-DR utilizzando il menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul cancello di poligono e disegnare un cancello per escludere le celle di bassa alta/CD14 HLA-DR (B cellule esprimono alti livelli di HLA-DR ma non CD14) (Figura 1E).Nota: contaminazione delle cellule B può verificarsi e quindi dovrebbe essere studiata. Se la popolazione non-classica in Figura 1 non è distinta dalle cellule alla sua sinistra, poi la contaminazione è probabile. Passaggio 3.5 può essere ignorato se le cellule B non sono sovrapposte con i monociti non-classica. Selezionare le celle con cancello e utilizzare il menu a discesa per visualizzarle su un terreno di CD16/CD14. Opzioni di stampa selezionare “Trama di Zebra” che consentirà di gates sottoinsieme del monocito deve essere disegnato per determinare le proporzioni sottoinsieme (Figura 1F).Nota: se zebra trama non è disponibile il software di analisi, pseudo colore (liscio) o contorno trama potrebbe essere adatto. Fare clic sull’icona cancello rettangolare e selezionare i monociti classici disegnando un approssimativo cancello rettangolare intorno alla popolazione di alta/CD16 basso, classica monociti CD14. In “Visualizzazione” selezionare “Visualizza mediane” per visualizzare l’intensità di fluorescenza mediano per i monociti classici. Regolare il cancello in modo che la popolazione ha una distribuzione uguale dalla mediana a sinistra e a destra che comprende tutte le celle a sinistra. Selezionare la popolazione intermedia disegnando un cancello rettangolare che racchiude le celle a destra del cancello classico. Regolare la parte inferiore del cancello per escludere le cellule non-classica allineando il cancello con il fondo dei cerchi concentrici che sono completamente entro il cancello classico del monocito, che assicura che il sottoinsieme intermedio ha un’espressione di CD14 paragonabile alla principale classica popolazione coerenza con la nomenclatura attuale. Cancello il sottoinsieme non classici disegnando una scatola rettangolare verso il basso dal bordo inferiore del sottoinsieme intermedio, selezionare tutte le celle verso il basso della popolazione (Figura 1F). In “Visualizzazione” selezionare “Visualizza le frequenze cancello” per determinare la percentuale di ogni sottoinsieme del monocito. 4. convalida del metodo di Gating Per determinare se i tipi di cellule potenzialmente contaminanti sono efficacemente gated-out, in primo luogo identificare popolazioni differenti delle cellule con anticorpi contro le cellule di T (CD3), cellule di B (CD19), neutrofili (CD66b) e le cellule NK (CD56) (Figura 2).Nota: Qui T cellule e neutrofili non sedersi vicino la forma di “┐” dei monociti e sono gated fuori in Figura 1. Confermare che le cellule NK vengono rimossi al punto 3.4 (Figura 1), e le cellule B vengono rimossi nel passaggio 3.5 (Figura 1E) come mostrato nella Figura 3. Se le cellule NK o cellule B non sono gated-out, regolare nuovamente le porte. 5. fenotipica del monocito dell’espressione dei Marker Selezionare le celle da ogni sottoinsieme del monocito. Modificare i parametri di elenco a discesa per creare un istogramma per ogni sottoinsieme di monociti (Figura 1F) visualizzando ogni marcatore e sua isotipo corrispondente (Figura 4). Calcolare il grado di espressione di ogni segno (mediana o media geometrica) rispetto al controllo di isotipo rispettivi.

Representative Results

La strategia di gating del monocito e analisi di citometria a flusso usato qui (Figura 1) con successo recintato i sottoinsiemi del monocito e rivelato loro proporzioni relative. Le proporzioni (per questo esempio) sono state calcolate come 88,1% classici, 4,33% intermedi e 7.49% non-classici. Questi cancelli sottoinsieme non sono stati contaminati con le cellule B, cellule T, neutrofili o cellule NK, che è stata confermata con marcatori CD19, CD3, CD56 e CD66b, rispettivamente. Valutando la posizione relativa delle altre popolazioni, è chiaro che le cellule T ed i neutrofili non rientrano bene la forma del monocito “┐” su un terreno di CD16/CD14 (Figura 2A e 2D). Tuttavia, sia le cellule NK e popolazioni di cellule B sovrappongono con la popolazione non-classica del monocito (Figura 2B e 2C). I passaggi della strategia gating (Figura 1 e 1E) sono stati confermati per escludere le cellule NK (Figura 3A) e cellule di B (Figura 3B). Anche se la popolazione delle cellule B inclusa una piccola porzione dei monociti non-classica, la quantità era trascurabile. Avendo gated i sottoinsiemi, il grado a cui essi espressi diversi marcatori di superficie, M1 (CD64, CD86 e CD120b) e M2 (CD163, CD11b e CD93) è stata valutata. I marcatori ha mostrato espressione positiva rispetto ai corrispondenti controlli isotipo, come visto tramite lo spostamento degli istogrammi (Figura 4). La mediana dei marcatori è stato superiore a quello dei controlli isotype. Applicazione di questa strategia di gating per un campione di sangue, che era suddivisa in quattro tubi, macchiato e analizzato separatamente, rendimenti risultati comparabili tra i tubi (tabella 4). Figura 1: rappresentanza monocito gating strategia nel sangue umano intero. (A) FSC(A) vs FSC(H) trama: le cellule che hanno un uguale area ed altezza di Gating, eliminando in tal modo ciuffi (FSC(A) maggiore rispetto al FSC(H)) e detriti (bassissima FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) trama: ampia selezione dei monociti in base alle loro proprietà SSC/FSC. (C) CD16 vs CD14 trama: Gating per selezionare monociti basato sulla loro forma caratteristica “┐”. (D) CD16 vs HLA-DR trama: Gating di selezionare cellule positive HLA-DR e rimuovere le cellule NK. (E) CD14 vs HLA-DR: Gating di escludere le cellule di B (HLA-DR alta/CD14 basso) da monociti. (F) selezionato monociti rivisualizzati il CD16 vs CD14 trama a cancello i sottoinsiemi del monocito. Per A-F colore rappresenta la densità delle cellule con blu e verde che indica bassa densità, rosso e arancione che indica ad alta densità e arancione che indica la densità di mid-range. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: convalida di gating strategia di identificazione di potenzialmente contaminanti cellule. Le cellule potenzialmente contaminanti sono identificate da marcatori cellule (A) T (CD3), linfociti (B), B (CD19), cellule NK (C) (CD56) e neutrofili (D) (CD66b). I pannelli di sinistra Visualizza identificazione di ogni popolazione dopo gating come da Figura 1A e 1B, con colore che rappresenta la densità delle cellule dall’alto (rosso) a bassa (blu). I pannelli di destra mostrano ogni popolazione cellulare (blu) sovrapposta la trama di CD16/CD14 monocito finale per rivelare la vicinanza di queste popolazioni di monociti (rossi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: conferma che gating passaggi rimuovere contaminanti cellule. Calore mappe che mostrano il grado di espressione da alta (rosso) a bassa (blu) di CD56 (A) e (B) CD19. Gating passaggi escludono con successo cellule con alta CD56 (cellule NK) e alta CD19 (linfociti B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: espressione del monocito di M1 (CD120b) e M2 (CD93) marcatori. Levigata istogrammi del monocito M1 e M2 (blu) mostrando il netto spostamento dall’isotipo (rosso) per (A) classici, prodotti intermedi (B) e (C) non-classici dell’espressione dei marker. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Anticorpo Volume (50 µ l di sangue) Volume (16x) 800 µ l di sangue CD14 – V450 Μ l 0.75 12 Μ l CD16 – APC 0,5 Μ l 8 Μ l HLA-DR-PerCP 0,625 Μ l 10 Μ l Tabella 1: Anticorpi per il flusso di sangue intero e mix master. Tubo Anticorpi PE Codice Isotype Match Concentrazione d’archivio Volume di lavoro 1 IgG1 BD (555749) NA 1,0 µ g/20 µ l 0,625 Μ l 2 CD163 BD (556018) BD IgG1 0.125 µ g/20 µ l 5 Μ l 3 CD64 BD (558592) BD IgG1 0.06 µ g/20 µ l 10 Μ l 4 IgG1 BD (555749) NA 1,0 µ g/20 µ l 1.25 Μ l 5 CD86 BD (555658) BD IgG1 1,0 µ g/20 µ l 1.25 Μ l 6 CD11b BD (561001) BD IgG1 1,0 µ g/20 µ l 1.25 Μ l 7 IgG2a R & S (IC003P) NA 25 µ g/mL 5 Μ l 8 CD120b (TNFRII) R & S (FAB226P) R & D IgG2a 25 µ g/mL 5 Μ l 9 IgG1 BL (400112) NA 0,2 mg/mL 2,5 Μ l 10 CD93 BL (336108) IgG1 BL 50 µ g/mL 1.25 Μ l Tabella 2: M1/M2-PE fluorocromo etichettato anticorpi monoclonali per il flusso di sangue intero. Tubo Anticorpo Volume di lavoro 11 CD3 5 Μ l 12 CD19 5 Μ l 13 CD66b 1.25 Μ l 14 CD56 5 Μ l Tabella 3: PE fluorocromo etichettato anticorpi monoclonali per i linfociti (cellule T, cellule B), i neutrofili e le cellule NK. Tubo % Classica % Intermedio % Non-classical 1 84,3 5.11 10.1 2 84,2 5.05 10.5 3 84,3 5.03 10.7 4 81,6 5.03 12.1 Tabella 4: Le proporzioni sottoinsieme del monocito da campione di un sangue macchiato e analizzato separatamente.

Discussion

Citometria a flusso di sangue intero è un approccio ideale per studiare i monociti come le cellule sono esaminate in condizioni prossime loro microambiente fisiologico fornire uno spaccato del loro ruolo nell’infezione e condizioni infiammatorie. Inoltre, l’uso di fresco (cioè, non trasformati) campioni di sangue riduce al minimo le alterazioni o trasformazioni delle cellule che possono verificarsi a causa di archiviazione o gestione18,19, come quelli che si verificano con i monociti congelare-sciolto 20. preparazione richiesta campione è raccomandato in quanto alcuni marcatori sono sovraregolati se i campioni sono conservati a temperatura ambiente prima dell’elaborazione19. Le concentrazioni ottimale di marcatori M1 e M2 sono state determinate mediante titolazione, e questo dovrebbe essere fatto per qualsiasi nuovo anticorpo limitare il legame non specifico assicurando nel contempo che il grado di spostamento è dovuto l’espressione dell’antigene e non limitato dalla mancanza di anticorpo. La rimozione dei globuli rossi e la fissazione delle cellule bianche del sangue con soluzione di Lisi è un passo importante in questo protocollo, in quanto la presenza di globuli rossi può interferire con il flusso cytometry21,22. Si noti che, mentre alcune soluzioni di lisi sono compatibili con la macchiatura no-lavaggio, popolazioni più chiare sono evidenti nelle nostre mani, quando un passaggio di lavaggio viene utilizzato.

Corretta installazione del citometro a flusso è anche critico quando si confrontano espressione degli indicatori del monocito. Si consiglia che i ricercatori mantengono l’intensità di fluorescenza di destinazione coerente di microsfere di controllo ed eseguire il controllo di qualità sullo strumento da utilizzare per fornire risultati coerenti attraverso diversi campioni eseguire in giorni diversi. Oltre a questo, isotype controlli vengono utilizzati per aiutare nell’interpretazione di qualsiasi segnale di fondo non specifici generati dall’anticorpo specifico non associazione. I monociti hanno alti livelli di recettori Fc11 e pertanto sono soggetti a legame non specifico. Della nota, il livello di legame non specifico differisce per i sottoinsiemi diversi, e quindi l’utilizzo di un controllo di isotipo diventa importante quando si confrontano il grado di espressione di marcatori tra sottoinsiemi.

Un altro criterio importante da considerare è la procedura gating impiegata. Alcuni studi suggeriscono che è fondamentale per disegnare un cancello stretto intorno il monocito popolazione in FSC(A)/SSC(A) complotto per sbarazzarsi della maggior parte delle non-monocytic CD16 cellule positive23,24,25, ma questo può portare alla perdita di alcuni monociti, cellule monocito-non possono sovrapporsi con i monociti su FSC/SSC trame26. Piuttosto, per escludere eventuali altre cellule del sangue che potrebbero contaminare i monociti, l’inclusione di un terzo marcatore del monocito oltre CD14 e CD16, è essenziale26,27. Per questo motivo, HLA-DR è usato spesso ed è ideale in quanto non è espressa da NK cellule o neutrofili17,28. Anche se i linfociti (cellule B e le cellule di T) possono esprimere HLA-DR, si differenziano dai monociti rispetto all’espressione di CD14. Mentre HLA-DR è un marcatore ideale di terzo, CD86 è stato raccomandato anche5,27,29 ma non è stato utilizzato qui come è anche un indicatore di M1 e così il suo grado di espressione su sottoinsiemi del monocito è stata valutata.

Convalida della strategia gating utilizzata è di importanza cruciale. Mentre le cellule NK sono noti a sovrapporsi con non-classici, se essi non sono gated fuori28, notiamo che le cellule B possono sovrapporsi anche con i non-classici (Figura 2B); Se questo è il caso in altri studi può dipendere la scelta del fluorocromo, configurazione dello strumento, sensibilità rivelatore o anche la condizione di malattia in esame. Qui, la sovrapposizione B cellule hanno mostrato un’alta espressione di HLA-DR e non erano gated fuori dalla selezione di cellule positive HLA-DR in Figura 1. Piuttosto, per rimuovere le cellule B abbiamo usato un ulteriore terreno di CD14 / HLA-DR, dove le cellule B separano da non-classici a causa della loro maggiore HLA-DR e bassa espressione di CD14.

Ci sono anche molti modi diversi in cui sono state tratte le porte per i monociti stessi nella letteratura; Questi includono quadranti (i sottoinsiemi sono separati da marcatori quadrante) e scatole rettangolare o trapezoidale,13 (con scatole separate disegnato per ogni sottoinsieme) che inoltre differiscono da nella loro collocazione delineazione dove uno sottoinsieme finisce e inizia un altro. Queste differenze probabilmente riflettono il fatto che i monociti esistano come un continuum delle cellule, differenziazione da classico a tronchetti, piuttosto che come chiaramente distinte popolazioni. Tuttavia, perché variazioni nelle tecniche per identificare i sottoinsiemi stessi possono portare a differenze nelle proporzioni sottoinsieme calcolato del monocito, diventa importante che il metodo gating è ragionevolmente oggettivi, piuttosto che soggettive, come questo rendere il metodo più affidabile e riproducibile. Alcuni studi utilizzano un controllo di isotipo per CD16 per determinare il confine tra il classico e intermedi sottoinsiemi30. D’altra parte, per definire la separazione tra intermedi e non-classici, è stato proposto che la linea di demarcazione può essere verticale o obliquo, con la scelta fino agli investigatori, condizione che dovrebbe essere riproducibile, ma un cancello rettangolare è stato raccomandato per facilitare i confronti tra studi13,30,31. Qui, una maggiore obiettività è stata ottenuta tracciando i dati su un terreno di zebra e l’applicazione di regole oggettive di visual, perché zebra trame forniscono una stecca di visualizzazione aggiuntive mescolando la sfumatura di colore per ogni bin uguale probabilità sopra una trama di contorno tradizionale. Il bordo destro del sottoinsieme classico è stato tale che la popolazione era distribuita uniformemente intorno la mediana della popolazione. La divisione fra i prodotti intermedi e non-classici sono stata standardizzata anche avendo la base degli intermedi allineare con il fondo dei cerchi concentrici all’interno della popolazione classica (cioè, la popolazione intermedia chiaramente esprime elevati livelli di CD14, secondo la nomenclatura standard1).

Mentre alcuni studi hanno suggerito l’uso di ulteriori indicatori, quali tipo di C-C chemokine receptor 2 (CCR2) o 6-sulfo LacNAc (SLAN) per ottenere successo enumerazione dei monociti e di rivelare il loro significato clinico32,33 , nelle nostre mani il livello di espressione di molti marcatori funzionali del monocito varia ampiamente tra gli individui14. Tale variazione può limitare l’utilità di questi indicatori per definire sottoinsiemi basati sulla loro espressione. Automatizzato di approcci computazionali sono stati utilizzati anche per visualizzare e cluster sottoinsiemi del monocito compreso visual interattiva stocastico vicino di casa incorporamento (viSNE), t-distribuito stocastico prossimo incorporamento (tSNE) o progressione di Spanning-tree Analisi di densità-normalizzato eventi (SPADE)34,35, in grado di fornire una rappresentazione visiva delle celle basate sul set di marcatori più utilizzati. Mentre questo è stato indicato per aumentare l’accuratezza della strategia di gating in classificazione sottoinsieme del monocito, è riconosciuto che un inconveniente è il numero di anticorpi (e canali corrispondenti fluoroforo) richiesto. La sua utilità dipenderà molto le domande; la complessità supplementare non può essere giustificata, ad esempio, negli studi di enumerazione.

Monociti recintati con la nostra tecnica mostrano le proporzioni in linea con la letteratura e l’espressione di marcatori di superficie di tre sottoinsiemi può essere determinata facilmente. Nel complesso, la tecnica e la metodologia spiegato qui fornisce un metodo semplice e standardizzato di enumerazione di proporzioni sottoinsieme del monocito e valutare espressione dei marker di superficie, che può essere estesa per includere altri marcatori pure, quindi convalida il loro ruolo funzionale in varie condizioni.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Citometria a flusso è stata eseguita nel flusso Cytometry Core Facility è supportato dal Westmead Institute for Medical Research, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales e National Health and Medical Research Council. Questo studio è stato sostenuto dal fondo formazione e di ricerca di chimica clinica.

Materials

BD vacutainer blood collection set Becton Dickinson 367286
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml Becton Dickinson 7128959
Phospahate Buffered Saline (PBS) Lonza 17-516F
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) Invitro technologies 352054
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] BD Biosciences 560349
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] Abcam Australia ab140477
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] BioLegend 307628
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] BD Biosciences 555749 Lot # 4283901
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] BD Biosciences 556018 Lot # 2335626
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] BD Biosciences 558592 Lot # 36768
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] BD Biosciences 555658 Lot # 3109766
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] BD Biosciences 561001 Lot # 3228959
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] R&D Systems IC003P Lot # 1212031
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] R&D Systems FAB226P Lot # 612051
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] BioLegend 400112 Lot # B220359
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] BioLegend 336107 Lot # B143544
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] BD Biosciences 347347 Lot # 3010929
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] BD Biosciences 561741 Lot # 2307721
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] BD Biosciences 561903 Lot # 3011796
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] BioLegend 305105 Lot # B154037
OptiLyse C Beckman Coulter A11895
Formaldehyde solution 37% Sigma F1635
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD Biosciences
Automatic haematology analyser, XT-1800i Sysmex
Centrifuge GS-6R Beckman
Flowjo software v10.0.7 Tree Star Inc
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Riferimenti

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Marimuthu, R., Francis, H., Dervish, S., Li, S. C., Medbury, H., Williams, H. Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (140), e57941, doi:10.3791/57941 (2018).
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