Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Monocyte Teilmengen von Vollblut Durchflusszytometrie. Dazu gehören wie Tor die Teilmengen und bewerten ihren Ausdruck der oberflächenmarker skizziert und geben ein Beispiel für die Beurteilung des Ausdrucks (entzündlich) M1 und M2-Marker (entzündungshemmend).
Abstract
Monozyten sind wichtige Mitwirkende in verschiedenen entzündlichen Erkrankungen und Veränderungen an diesen Zellen, einschließlich ihrer Teilmenge Proportionen und Funktionen, können pathologische Bedeutung haben. Eine ideale Methode für die Prüfung von Änderungen an Monozyten ist Vollblut-Durchflusszytometrie, da die minimale Handhabung von Proben von dieser Methode Serums Zellaktivierung beschränkt. Jedoch sind viele verschiedene Ansätze unternommen, um die Monocyte Teilmengen führt zum inkonsistenten Identifikation der Teilmengen zwischen Studien Tor. Hier zeigen wir eine Methode mit Vollblut Durchflusszytometrie zu identifizieren und zu charakterisieren, menschliche Monocyte Teilmengen (klassische, zwischen- und nicht-klassischen). Wir skizzieren zur Vorbereitung der Blutproben für Durchflusszytometrie, Tor der Teilmengen (stellen Sie sicher, kontaminierende Zellen entfernt wurden) und Monocyte Teilmenge Ausdruck der oberflächenmarker zu bestimmen – in diesem Beispiel M1 und M2-Marker. Dieses Protokoll ist erweiterbar auf andere Studien, die eine Standardmethode gating erfordern für die Beurteilung der Monocyte Teilmenge Proportionen und Monocyte Teilmenge Ausdruck von anderen funktionellen Markern.
Introduction
Monozyten sind eine Art von weißen Blutkörperchen, die eine wichtige Rolle bei der Förderung und Entzündung zu lösen. Es gibt drei wichtigsten Teilmengen von Monozyten anerkannte, klassische (~ 85 %), Fortgeschrittene (~ 5 %) und nichtklassischen (~ 10 %) Monozyten, die sich durch ihr Niveau der Cluster der Differenzierung (CD) 14 und CD16 Ausdruck1auszeichnen. Die Proportionen der Monocyte Teilmengen können abweichen, mit dem Vorhandensein von Krankheiten, wie z. B. ein erhöhter Anteil von Zwischenprodukten in verschiedene entzündliche Staaten2,3 einschließlich Herz-und Kreislauferkrankungen, wo das Niveau der Zwischenprodukte ist im Zusammenhang mit klinischen Ereignisse4,5. Darüber hinaus können Erkrankungen, Monozyten auch funktionelle Veränderungen, mit vielen Veränderungen nachweisbar durch einen Unterschied in der Oberfläche Marker Ausdruck6,7unterziehen. Ein solches Beispiel ist Monocyte M1-neigen, eine Zunahme der Marker, die mit M1 Makrophagen, die bei Herz-Kreislauf-Krankheiten, Diabetes, Adipositas und metabolisches Syndrom7,8,9 beobachtet wurde , 10.
Trotz der Popularität der Durchflusszytometrie Monocyte Teilmenge Proportion und Funktion zu beurteilen gibt es eine beträchtliche Variabilität in der Probenvorbereitung und Teilmenge gating zwischen Studien, die es schwierig macht, die Ergebnisse zwischen solchen Studien vergleichen. Wichtig ist, gibt es keinen Konsens in der Abgrenzung der Monocyte Teilmengen, doch ein standardisiertes Vorgehen unbedingt die klinische Bedeutung der Änderungen in Teilmenge Proportionen in verschiedene Krankheiten gegeben. Teil der Schwierigkeit in Anspritzung ergibt sich daraus, die Monozyten zu unterscheiden von der Klassik über die Mittelstufe der nichtklassischen Teilmenge11 und als solches Monozyten existieren unterschiedliche Populationen12, eher als ein kontinuierliches Spektrum . Interessanterweise zeigte Zawada Et Al. , dass verwenden entweder einen rechteckigen oder trapezförmigen Anspritzung der Mittelstufe Teilmenge, sowohl eine höhere mittlere Teilmenge geführt, die ein Herz-Kreislauf-Endpunkt13vorhergesagt. Dies macht deutlich, dass, zumindest für die Berechnung der Proportionen, die zentrale Frage eine konsequente gating Strategie zwischen verschiedenen Proben (Studien), anwendet anstatt zu versuchen, die endgültig zwischen Untergruppen unterscheiden. Während definitive Anspritzung wichtiger sein kann bei der Beurteilung der Funktion, die Veränderung der Marker Ausdruck zwischen Teilmengen ist inkrementelle12,14, und somit wieder, Konsistenz der gating ist vielleicht wichtiger. Als solche ist ein Ziel gating-Methode, die die Monocyte Teilmengen zwischen verschiedenen Proben reproduzierbar Verteilungen erforderlich. Die hier vorgestellte Methode soll Tor Monocyte Teilmengen mit einer klaren Erklärung und Rechtfertigung für die gating-Technik beschäftigt und bewerten die Teilmengen für Surface Marker Ausdruck, wodurch es eine Methode, die Forscher haben erlaubt Vertrauen in die Nutzung dieser Technik bei verschiedene Proben der Beurteilung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vollblut-Durchflusszytometrie ist ein idealer Ansatz, Monozyten zu studieren, wie die Zellen unter Bedingungen in der Nähe ihrer physiologischen Mikroumgebung bietet einen Einblick in ihre Rollen Infektionen und entzündlichen Erkrankungen untersucht werden. Darüber hinaus die Verwendung von frischen (d. h. unbearbeitet) Blutproben minimiert die Änderungen oder die Zelle Transformationen, die durch Lagerung oder Handhabung18,19, wie die bekanntermaßen auftreten, mit Einfrieren aufgetaut Monozyten entstehen können 20. schnelle Probenvorbereitung wird empfohlen, da einige Marker hochreguliert sind, wenn die Proben bei Raumtemperatur vor der Verarbeitung19gehalten werden. Die optimalen Konzentrationen von M1 und M2 Markierungen wurden durch Titration bestimmt, und dies sollte für jede neue Antikörper, unspezifischen Bindung zu begrenzen, gleichzeitig sicherstellen, dass der Grad der Verschiebung durch Antigen-Ausdruck wird und durch Mangel an Antikörpern nicht eingeschränkt. Die Entfernung der roten Blutkörperchen und Fixierung der weißen Blutkörperchen mit Lyse-Lösung ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll als Flow Cytometry21,22das Vorhandensein von roten Blutkörperchen stören kann. Beachten Sie, dass zwar einige Lyse-Lösungen kompatibel mit Nein-Wash beflecken, klarer Populationen sind deutlich in unseren Händen, wenn ein Waschschritt verwendet wird.
Richtige Setup das Durchflusszytometer ist auch wichtig, beim Ausdruck der Monocyte Marker zu vergleichen. Wir empfehlen, dass Forscher konsistent Ziel Fluoreszenz-Intensität von Kontrolle Perlen und Qualitätskontrollen auf dem Instrument führen verwendet werden, führen Sie konsistente Ergebnisse über verschiedene Proben an verschiedenen Tagen zu liefern. Darüber hinaus sind Isotype Steuerelemente zur Unterstützung bei der Interpretation der unspezifischen Hintergrundsignal generiert durch unspezifische Antikörperbindung verwendet. Monozyten haben ein hohes Maß von Fc-Rezeptoren11 und sind daher anfällig für unspezifische Bindung. Der Hinweis das Niveau der unspezifischen Bindung unterscheidet sich für die verschiedenen Untergruppen, und somit die Verwendung eines Isotype-Steuerelements wird wichtig, wenn den Grad der Marker Ausdruck zwischen Teilmengen zu vergleichen.
Ein weiteres wichtiges Kriterium zu berücksichtigen ist die gating Schritte eingesetzt. Einige Studien deuten darauf hin, dass es entscheidend zeichne eine enge Tor um die Monocyte Bevölkerung in FSC(A)/SSC(A) Plotten get rid of die meisten der nicht-monozytären CD16 positive Zellen23,24,25, aber dies kann zum Verlust von einigen Monozyten als nicht-Monocyte Zellen mit Monozyten auf FSC/SSC überschneiden können Grundstücke26. Um andere Blutzellen auszuschließen, die die Monozyten verunreinigen können, ist die Aufnahme einer dritten Monocyte Markierung neben CD14 und CD16, vielmehr wesentlich26,27. Aus diesem Grund HLA-DR wird häufig verwendet, und ist ideal, da es nicht durch NK Zellen oder Neutrophilen17,28zum Ausdruck kommt. Obwohl Lymphozyten (B-Zellen und T-Zellen) HLA-DR Ausdrücken können, unterscheiden sie sich von Monozyten in Bezug auf CD14 Ausdruck. HLA-DR ist eine ideale dritte Markierung, CD86 empfahl auch5,27,29 , aber nicht hier verwendet wurde ist auch ein M1-Marker und somit der Grad des Ausdrucks für Monocyte Teilmengen bewertet wurde.
Validierung der gating-Strategie verwendet ist von entscheidender Bedeutung. Obwohl NK-Zellen mit nicht-Dichtertreffen überlappen, wenn sie nicht28 eingezäunt sindbekannt sind, merken wir, dass B-Zellen auch überschneiden können, mit der nicht-Klassik (Abbildung 2 b); ob dies der Fall in anderen Studien ist möglicherweise abhängig von Fluorochrom Wahl, Gerätekonfiguration, Detektorempfindlichkeit oder sogar den Krankheitszustand geprüft wird. Hier die überlappenden B Zellen zeigten hohe Expression von HLA-DR und wurden nicht durch Auswahl der HLA-DR-positiven Zellen in Abbildung 1, gated. Vielmehr, um B-Zellen zu entfernen verwendet wir ein zusätzliches Grundstück von CD14 / HLA-DR, wo die B-Zellen trennen sich von nicht-Dichtertreffen aufgrund ihrer höheren HLA-DR und niedrige CD14 Ausdruck.
Es gibt auch viele verschiedene Möglichkeiten, in denen die Tore für die Monozyten selbst in der Literatur gezogen wurden; Dazu gehören Quadranten (die Teilmengen werden durch Quadrant Marker getrennt) und rechteckigen oder trapezförmigen Boxen13 (mit Einzelboxen für jede Teilmenge gezogen), die darüber hinaus unterscheiden sich in ihrer Platzierung abgrenzen, wo eine Teilmenge endet und eine andere beginnt. Wahrscheinlich diese Unterschiede reflektieren die Tatsache, dass Monozyten als ein Kontinuum von Zellen, Differenzierung von Klassik zu nichtklassischen, nicht als klar getrennte Populationen existieren. Jedoch da Variationen in Techniken zur Identifizierung von Teilmengen sich auf Unterschiede in den berechneten Monocyte Teilmenge Proportionen führen können, ist es wichtig, dass die gating Methode einigermaßen Objektiv, sondern als subjektiv, weil dadurch machen Sie die Methode, robuster und reproduzierbar. Einige Studien verwenden ein Isotype-Steuerelement für CD16 um die Grenze zwischen der klassischen und Zwischenprodukte Teilmengen30zu bestimmen. Auf der anderen Seite wurde um die Trennung von Zwischenprodukten und nicht Dichtertreffen definieren, vorgeschlagen, dass der Hell-Dunkelgrenze kann vertikal oder schräg, mit der Wahl bis zu den Ermittlern, der Maßgabe, dass es reproduzierbar sein sollte, aber ein rechteckiges Tor wurde empfohlen, um Vergleiche zwischen den Studien13,30,31zu erleichtern. Hier wurde erhöhte Objektivität durch zeichnen die Daten auf einem Grundstück von Zebra und Anwendung objektiver visual Rules gewonnen, weil Zebra Grundstücke eine zusätzliche Visualisierung Cue bieten durch Mischen Farbverlauf in jeweils gleicher Wahrscheinlichkeit bin über eine traditionelle konturdiagramm. Der Rechte Rand der klassischen Teilmenge wurde gezogen, so dass die Bevölkerung gleichmäßig um den Median der Bevölkerung verteilt wurde. Die Trennung zwischen dem Vermittler und nicht Dichtertreffen wurden auch dadurch, dass die Basis der Zwischenprodukte an der Unterseite der konzentrischen Kreise innerhalb der klassischen Bevölkerung ausgerichtet standardisiert (d. h. die mittlere Bevölkerung deutlich hohes Maß an CD14, wie pro die einheitliche Nomenklatur1drückt).
Während einige Studien vorgeschlagen haben die Verwendung von zusätzlichen Markierungen, wie C-C Chemokin-Rezeptor Typ 2 (CCR2) oder 6-Sulfo-LacNAc (SLAN) für den Erhalt der erfolgreiche Enumeration von Monozyten und offenbaren ihre klinische Bedeutung32,33 , in unseren Händen die Ebene des Ausdrucks von vielen Monocyte funktionellen Markern variiert stark zwischen den einzelnen14. Diese Variation kann die Nützlichkeit dieser Marker Teilmengen basierend auf ihren Ausdruck definieren beschränken. Automatisierte rechnergestützte Ansätze wurden auch verwendet, um zu visualisieren und cluster-Monocyte Teilmengen einschließlich visuelle interaktive stochastische Nachbar einbetten (ViSNE), t-verteilten stochastische Nachbar einbetten (tSNE) oder Spanning-Tree-Progression Analyse der Dichte normalisiert Ereignisse (Pik)34,35, die visuelle Darstellung der Zellen basierend auf dem Satz der verwendeten mehrere Marker zur Verfügung stellen können. Während dies zur Erhöhung der Genauigkeit der gating-Strategie in Monocyte Teilmenge Klassifizierung gezeigt wurde, ist es anerkannt, dass ein Nachteil die Anzahl der Antikörper (und entsprechenden Fluorophor Kanäle ist) erforderlich. Seine Nützlichkeit richtet sich nach den Fragen; die zusätzliche Komplexität kann nicht garantiert werden, z. B. in Aufzählung Studien.
Monozyten gated mit unserer Technik zeigen Proportionen im Einklang mit der Literatur und der Ausdruck der oberflächenmarker von drei Teilmengen leicht ermittelt werden. Insgesamt bietet die Technik und Methodik hier erklärt eine standardisierte und unkomplizierte Methode der Monocyte Teilmenge Proportionen auflisten und Bewertung von Surface Marker Ausdruck, die verlängert werden kann, sollen andere Marker sowie, damit Validieren ihre funktionalen Rollen in verschiedenen anderen Bedingungen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Durchflusszytometrie erklang in den Flow Cytometry Core Facility, die vom Westmead Institute for Medical Research, Westmead Research Hub, Cancer Institute New-South.Wales und National Health and Medical Research Council unterstützt wird. Diese Studie wurde unterstützt durch klinische Chemie Forschung und Bildungsfonds.
Materials
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 ml | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
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