Asignación de metabolismo: Supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato directamente en el tejido
Summary
Se describe un protocolo para el mapeo de la distribución espacial de la actividad enzimática de las enzimas que generan nicotinatmide adenina-dinucleótido-fosfato (NAD(P)H) + H + directamente en muestras de tejido.
Abstract
Asignación de actividad enzimática en el espacio y el tiempo es fundamental para entender las bases moleculares del comportamiento celular en tejido normal y la enfermedad. In situ el análisis de la actividad metabólica puede proporcionar información sobre la distribución espacial de la actividad metabólica dentro de un tejido. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el seguimiento de la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa directamente en muestras de tejido. Lactato deshidrogenasa es un factor determinante de si la glucosa consumida se convertirán en energía mediante glucólisis aeróbica o anaeróbica. Se proporciona una solución que contiene lactato y NAD a una sección de tejido congelado. Células con actividad alta lactato deshidrogenasa convierte el lactato siempre piruvato, mientras que al mismo tiempo convertir base de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) a NADH y un protón, que se puede detectar en la reducción de azul de formazán, que es visualizada como un precipitado de azul de nitrotetrazolio. Se describe un protocolo detallado para el seguimiento de actividad de lactato deshidrogenasa en piel de ratón. Aplicación de este protocolo, se encontró que la actividad de la lactato deshidrogenasa es alta en las células de vástago del folículo quieto dentro de la piel. Aplicar el protocolo a células madre embrionarias de ratón cultivados reveló la coloración mayor en células de vástago embrionarias cultivadas de fibroblastos embrionarios de ratón. Análisis de la aorta de ratón recién aislado revelaron la coloración en las células musculares lisas perpendiculares a la aorta. La metodología proporcionada puede utilizarse para el mapa espacial de la actividad de las enzimas que generan un protón en el tejido fresco o congelado.
Introduction
Entender las ubicaciones dentro de los tejidos en los que las enzimas tienen actividad alta o baja es esencial para la fisiología y desarrollo de la comprensión. Niveles de transcripción o de la proteína a menudo se utilizan como sustitutos para la actividad enzimática. Mientras que este tipo de estudios puede ser informativo, no proporcionan información que puede ser crítico para la determinación de actividad de una enzima, tales como las modificaciones post-traduccionales, la presencia de complejos de la proteína, o la localización subcelular de la enzima. Cuando la actividad enzimática se mide directamente, a menudo se controla en los lysates de homogeneizados de proteínas que no contienen información sobre células individuales dentro de la mezcla o la distribución espacial de las células con actividad alta o baja dentro de un tejido.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el mapeo de la distribución espacial de la actividad enzimática dentro de una muestra de tejido. La metodología se basa en estudios anteriores demostrando que sales de tetrazolio pueden utilizarse para localizar la actividad de Deshidrogenasas reductasas y oxidasas en el tejido congelado1. Con estos métodos, un precipitado insoluble en agua se forma cuando los protones son transferidos a un tetrazolio sal2,3. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa genera NADPH y un protón y se ha detectado actividad de tetrazolio. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ha sido monitoreada en platija Europea hepatocitos4, en las células alveolares tipo 2 de los pulmones5 y nefronas del riñón5. Sales de tetrazolio también se han utilizado para supervisar la actividad de la transcetolasa en tejido congelado6. Un acercamiento similar fue utilizado recientemente para supervisar la actividad de Deshidrogenasas múltiples en el mismo tejido en diapositivas adyacentes7.
Aquí describimos un método para utilizar sales de tetrazolio para supervisar la distribución espacial de la actividad de la deshidrogenasa del lactato (figura 1). Lactato deshidrogenasa puede convertir el piruvato generado por glucólisis a lactato y la reacción inversa. Actividad de la lactato deshidrogenasa, en consecuencia, es un determinante importante de la entrada de piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico versus su secreción como lactato. Niveles de lactato en la sangre a menudo se utilizan para diagnosticar una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer8,9,10, porque puede indicar que la lesión o enfermedad ha dañado las células y la enzima ha sido liberada.
Hay cuatro genes de la lactato deshidrogenasa: LDHA, LDHB, LDHC y LDHD11. Se cree que han surgido de la duplicación de un temprano LDHA gene12LDHA y LDHB. LDH es activa como un tetrámero y LDHA y LDHB pueden formar homotetramers y heterotetramers uno con el otro. LDHA se divulga para tener una mayor afinidad por el piruvato, mientras que LDHB se divulga para tener una mayor afinidad por el lactato y preferentemente convertir lactato a piruvato13. El promotor LDHA contiene sitios de Unión para los HIF1α, cMYC y FOXM1 transcripción factores11. Además, como muchas otras enzimas glicolíticas14,15, LDH puede ser modificada por modificaciones post-traduccionales. Receptor de factor de crecimiento fibroblástico 1 puede fosforilan LDHA Y10, que promueve la formación de tetrámero, o Y83, que promueve la NADH sustrato Unión16. LDHA también puede ser acetilado17. Por estas razones, una comprensión completa de la actividad LDH requiere supervisión no sólo los niveles de proteínas LDH y actividad de la enzima.
Además el método que presentamos aquí, otros enfoques se han utilizado para supervisar la actividad de la lactato deshidrogenasa. Actividad de la deshidrogenasa de lactato puede ser monitoreado espectrofotométricamente en lisado homogenizada proteína. La generación de NADH como lactato se convierte en piruvato puede ser medida basada en absorbancia a 340 nm, mientras que la desaparición de NADH puede controlarse como piruvato es convertido a lactato18. Actividad de la lactato deshidrogenasa también ha sido monitoreado con la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). 13 C piruvato puede ser administrada y la conversión de piruvato a lactato puede ser monitoreada como la relación entre [1 –13C] lactato / [1 –13C] piruvato. Elevados ratios de [1 –13C] lactato / [1 –13C] piruvato se han observado en tejido de cáncer19. Mientras que los enfoques basados en la MRI pueden proporcionar información sobre actividad de la deshidrogenasa del lactato en condiciones normales y los tejidos de la enfermedad, las metodologías no tienen la resolución necesaria para determinar el nivel de actividad en células específicas. La metodología que aquí puede proporcionar información sobre la actividad de la lactato deshidrogenasa en las áreas de tejido e incluso en las células.
Mediante ensayos de actividad en situ , encontramos que la actividad de la lactato deshidrogenasa es alta en las células de vástago del folículo de pelo de piel de ratón20. También se usó el método para monitorear la actividad de lactato deshidrogenasa en las células madre embrionarias cultivadas y la actividad es mayor en las células de la capa de alimentador. Finalmente, supervisar la actividad de la lactato deshidrogenasa en aorta de ratón fresco y observó tinción en las células musculares lisas. Describimos aquí un protocolo detallado para el seguimiento de actividad de lactato deshidrogenasa en piel de ratón congelado.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método aquí descrito puede utilizarse para supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato u otras enzimas metabólicas que generan NADH o NADPH, en diferentes tipos celulares dentro de un tejido o diferentes porciones de un tejido con el tiempo. Lactato deshidrogenasa es una enzima importante para la comprensión de la biología de los tumores y las células madre, y la capacidad para monitorear la actividad de la lactato deshidrogenasa en las células individuales es probable que proporcionar penetracione…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones a HAC de nacional Instituto de R01 de ciencias médicas General GM081686 R01 AR070245, del Instituto Nacional de (médico General) Ciencias R01 GM0866465, la Eli y Edythe amplia centro de medicina regenerativa y Stem Cell Research Rose Hills y Hal Gaba premios), centro de salud/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, la sociedad de la leucemia linfoma, impacto el Iris Cantor de la mujer premios de Jonsson Comprehensive Cancer Center a WEL y HAC. Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P50CA092131. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. HAC es un miembro de la Eli y Edythe amplia centro de medicina regenerativa e investigación de células madre, el Instituto de Biología Molecular de la UCLA y el programa interdepartamental de Bioinformática de UCLA.
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
Riferimenti
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