Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto
Summary
Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell’attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.
Abstract
Mappatura attività enzimatica nello spazio e nel tempo è fondamentale per comprendere le basi molecolari del comportamento delle cellule nel tessuto normale e malattia. Le analisi in situ attività metabolica possono fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle attività metabolica all’interno di un tessuto. Forniamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l’attività dell’enzima lattato deidrogenasi direttamente nei campioni di tessuto. Lattato deidrogenasi è un determinante importante di se consumato glucosio verrà convertito in energia mediante glicolisi aerobica o anaerobica. Una soluzione contenente lattato e NAD è fornita di una sezione di tessuto congelato. Cellule con attività alto lattato deidrogenasi converte il lattato fornito a piruvato, mentre convertendo simultaneamente fornito nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) a NADH e un protone, che può essere rilevato sulla base della riduzione di nitrotetrazolium blu di formazan, che è visualizzato come un precipitato blu. Descriviamo un protocollo dettagliato per monitorare l’attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo. Applicazione del presente protocollo, abbiamo trovato che l’attività della deidrogenasi del lattato è alta nelle cellule staminali del follicolo pilifero quiescente all’interno della pelle. Applicazione del protocollo di cellule staminali embrionali di topo coltivate ha rivelato la macchiatura più alto in cellule staminali embrionali coltivate di fibroblasti embrionali del mouse. Analisi dell’aorta del mouse appena isolato ha rivelato la macchiatura in cellule di muscolo liscio perpendicolare all’aorta. La metodologia fornita può essere utilizzata per mappare spazialmente l’attività degli enzimi che generano un protone nel tessuto fresco o congelato.
Introduction
Capire le posizioni all’interno dei tessuti in cui gli enzimi hanno attività alta o bassa è essenziale per la fisiologia e sviluppo di comprensione. Livelli di trascrizione o di proteine sono spesso utilizzati come surrogati per l’attività enzimatica. Mentre tali studi possono essere ben informativi, non forniscono informazioni che possono essere critici per determinare l’attività di un enzima, quali modificazioni post-traduzionali, la presenza di complessi proteici, o localizzazione subcellulare dell’enzima. Quando l’attività enzimatica è misurata direttamente, spesso è monitorato nei lisati di omogeneizzato proteine che non contengono informazioni su singole celle all’interno della miscela o la distribuzione spaziale delle cellule con alta o bassa attività all’interno di un tessuto.
Forniamo qui un protocollo dettagliato per mappare la distribuzione spaziale dell’attività enzimatica all’interno di un campione di tessuto. La metodologia si basa su precedenti studi che dimostrano che sali di tetrazolio possono essere utilizzati per localizzare l’attività della deidrogenasi, riduttasi e ossidasi in tessuto congelato1. Con questi metodi, un formazan insolubili in acqua si forma quando protoni vengono trasferiti a un tetrazolium sale2,3. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi genera NADPH e un protone ed è stata rilevata con attività di tetrazolium. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi è stata monitorata epatociti Platichthys flesus4, nelle cellule alveolari di tipo 2 del polmoni5 e nefroni del rene5. Sali di tetrazolio sono stati utilizzati anche per monitorare l’attività di transketolase in tessuto congelato6. Un approccio simile è stato recentemente utilizzato per monitorare l’attività della deidrogenasi multiple nel tessuto stesso su diapositive adiacenti7.
Descriviamo qui un metodo per utilizzare sali di tetrazolio per monitorare la distribuzione spaziale delle attività della deidrogenasi del lattato (Figura 1). Lattato deidrogenasi può convertire piruvato generato da glicolisi di lattato e la reazione inversa. L’attività della deidrogenasi del lattato è di conseguenza un determinante importante dell’entrata di piruvato nel ciclo dell’acido tricarbossilico contro sua secrezione come lattato. Livelli di lattato nel sangue sono spesso utilizzati per diagnosticare una gamma di malattie, compreso cancro8,9,10, perché può segnalare che la malattia o infortunio ha danneggiato le cellule e l’enzima è stato rilasciato.
Ci sono quattro geni di lattato deidrogenasi: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD11. LDHA e LDHB sono pensati per risultare dalla duplicazione di un gene di iniziali LDHA12. LDH è attivo come un tetramero e LDHA e LDHB possono formare homotetramers ed eterotetrameri con a vicenda. LDHA è segnalato per avere maggiore affinità per piruvato, mentre LDHB è segnalato per avere maggiore affinità per lattato e preferenzialmente convertire lattato in piruvato13. Il promotore LDHA contiene siti di legame per fattori di trascrizione HIF1α, cMYC e FOXM111. Inoltre, come molti altri enzimi glicolitici14,15, LDH può essere modificato da modificazioni post-traduzionali. Ricevitore di fattore di crescita del fibroblasto 1 può fosforilare LDHA Y10, che promuove la formazione di tetramero, o Y83, che promuove il NADH substrato associazione16. LDHA può anche essere acetilata17. Per questi motivi, una comprensione completa delle attività LDH richiede un monitoraggio non solo i livelli di proteina LDH, ma l’attività dell’enzima pure.
Oltre al metodo che presentiamo qui, altri approcci sono stati utilizzati per monitorare l’attività della deidrogenasi del lattato. L’attività della deidrogenasi del lattato può essere monitorata spettrofotometricamente a lisato proteico omogeneizzato. La generazione del NADH come lattato viene convertito in piruvato può essere misurata basata su assorbanza a 340 nm, mentre la scomparsa del NADH può essere monitorata come piruvato viene convertito in lattato18. L’attività della deidrogenasi del lattato è stata monitorata anche con risonanza magnetica (MRI). 13 C-piruvato può essere somministrato e la conversione di piruvato a lattato possa essere monitorata come il rapporto di [1 –13C] lattato / [1 –13C] piruvato. Elevati coefficienti di [1 –13C] lattato / [1 –13C] piruvato sono stati osservati in cancro del tessuto19. Mentre gli approcci basati su MRI possono fornire informazioni sulle attività della deidrogenasi del lattato nel normale e tessuti malattia, le metodologie non hanno la risoluzione necessaria per determinare il livello di attività in celle specifiche. La metodologia fornita qui può fornire informazioni sull’attività della deidrogenasi del lattato in aree di tessuto e anche in singole cellule.
Usando in situ analisi di attività, abbiamo trovato che l’attività della deidrogenasi del lattato è ricco di cellule staminali del follicolo pilifero di mouse pelle20. Abbiamo anche usato il metodo per monitorare l’attività del lattato deidrogenasi in cellule staminali embrionali coltivate e l’attività è più alto nelle cellule staminali dello strato dell’alimentatore. Infine, abbiamo monitorato l’attività del lattato deidrogenasi nell’aorta del mouse fresco e osservato la macchiatura in cellule di muscolo liscio. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l’attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo congelati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare l’attività della deidrogenasi del lattato o altri enzimi metabolici che generano NADH o NADPH, in diversi tipi cellulari all’interno di un tessuto o di diverse porzioni di un tessuto nel corso del tempo. Lattato deidrogenasi è un enzima importante per la comprensione della biologia delle cellule staminali e tumori, e la capacità di monitorare l’attività della deidrogenasi del lattato in singole celle rischia di fornire le comprensioni importanti nella funz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute di R01 di scienze mediche generali GM081686, R01 AR070245, Istituto nazionale di generali (Medical Sciences R01 GM0866465, Eli ed Edythe Broad centro di medicina rigenerativa e ricerca sulle cellule staminali Colline di rose e Hal Gaba awards), Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, alla Leukemia Lymphoma Society, impatto Iris Cantor femminile premi da Jonsson Comprehensive Cancer Center a WEL e HAC. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & ricerca sulle cellule staminali, l’Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
Riferimenti
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