رسم الخرائط الأيض: رصد النشاط نازعة لاكتات مباشرة في الأنسجة
Summary
يمكننا وصف بروتوكول لرسم خرائط التوزيع المكاني للنشاط الأنزيمي للإنزيمات التي تولد نيكوتيناتميدي الأدنين وأميد النيكوتنك (NAD(P)H) + H + في عينات الأنسجة مباشرة.
Abstract
تعيين النشاط الأنزيمي في الزمان والمكان أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي لسلوك الخلية في أنسجة طبيعية والمرض. فحوصات النشاط الأيضي في الموقع يمكن أن توفر معلومات عن التوزيع المكاني لنشاط التمثيل الغذائي داخل أنسجة. نحن نقدم هنا بروتوكولا مفصلاً لرصد نشاط إنزيم لاكتات نازعة في عينات الأنسجة مباشرة. لاكتات نازعة محدداً هاما لما إذا كان سيتم تحويل الجلوكوز المستهلكة للطاقة عن طريق تحلل الهوائية أو اللاهوائية. يتم توفير محلول يحتوي على لاكتات وند لقسم أنسجة مجمدة. سيتم تحويل الخلايا ذات النشاط العالي لاكتات نازعة لاكتات المقدمة إلى بيروفات، بينما في نفس الوقت تحويل توفير نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD) إلى NADH وبروتون، التي يمكن الكشف عنها استناداً إلى الحد من نيتروتيترازوليوم الأزرق إلى فورمازان، الذي هو تصور ترسبات زرقاء. يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لمراقبة نشاط نازعة لاكتات في الجلد الماوس. تطبيق هذا البروتوكول، وجدنا أن النشاط نازعة لاكتات مرتفع في الخلايا الجذعية هادئة الشعرة داخل الجلد. وكشف تطبيق البروتوكول على الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مثقف تلطيخ أعلى في استزراع الخلايا الجذعية الجنينية من الخلايا الليفية الجنينية الماوس. كشف تحليل للشريان الاورطي الماوس طازجة معزولة تلطيخ في خلايا العضلات الملساء عمودي للشريان الاورطي. يمكن استخدام المنهجية المقدمة إلى خريطة مكانياً نشاط الإنزيمات التي تولد بروتون في الأنسجة المجمدة أو الطازجة.
Introduction
فهم المواقع داخل الأنسجة التي يكون للإنزيمات مرتفعة أو منخفضة النشاط أمر ضروري لفهم التنمية وعلم وظائف الأعضاء. كثيرا ما تستخدم مستويات نسخة أو البروتين كالأمهات البديلات للنشاط الأنزيمي. وفي حين يمكن أن تكون مثل هذه الدراسات مفيدة، أنها لا توفر المعلومات التي يمكن أن تكون حاسمة بالنسبة لتحديد نشاط إنزيم في، مثل التعديلات بوستترانسلاشونال، ووجود البروتين المجمعات، أو الترجمة للانزيم سوبسيلولار. عندما يتم قياس النشاط الأنزيمي مباشرة، فإنه غالباً ما رصد في ليساتيس البروتين المتجانس التي لم تعد تحتوي على معلومات حول الخلايا الفردية داخل الخليط أو التوزيع المكاني للخلايا مع نشاط عالية أو منخفضة داخل أنسجة.
نحن نقدم هنا بروتوكول مفصل لرسم خرائط التوزيع المكاني للنشاط الأنزيمي داخل عينة أنسجة. وتستند المنهجية الدراسات السابقة مما يدل على أنه يمكن استخدام أملاح تيترازوليوم لتعريب النشاط ديهيدروجيناسيس، وريدوكتاسيس، وأوكسيداسيس في الأنسجة المجمدة1. بهذه الأساليب، تتشكل formazan تستعصي على الحل المياه عندما يتم نقل البروتونات إلى سولت2،تيترازوليوم3. نازعة الجلوكوز-6-فوسفات يولد نادف وبروتون، وتم الكشف عن نشاط تيترازوليوم. وقد تم رصد نازعة الجلوكوز-6-فوسفات في السمك المفلطح الأوروبي خلايا الكبد4، في الخلايا السنخية النوع 2 من الرئتين5 والنيفرون الكلي5. كما استخدمت أملاح تيترازوليوم لرصد النشاط transketolase في الأنسجة المجمدة6. واستخدمت مؤخرا نهجاً مماثلاً مراقبة نشاط dehydrogenases متعددة في نفس الأنسجة على الشرائح المجاورة7.
يصف لنا هنا أسلوب استخدام أملاح تيترازوليوم لمراقبة التوزيع المكاني للنشاط نازعة لاكتات (الشكل 1). ويمكن تحويل نازعة لاكتات بيروفات المتولدة عن تحلل اللبن، ورد فعل عكسي. النشاط نازعة لاكتات نتيجة لذلك محدداً هاما لدخول بيروفات دورة حمض تريكاربوكسيليك مقابل لها إفراز كما لاكتات. كثيرا ما تستخدم مستويات اللاكتات في الدم لتشخيص مجموعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان8،،من910، نظراً لأنه يمكن الإشارة أن المرض أو الإصابة أضرار الخلايا وقد تم الإفراج عن الإنزيم.
وهناك أربعة اللاكتات نازعة الجينات: لدها، لدب، لدهك، ولدهد11. ويعتقد أن نشأت من الازدواجية في أوائل الجينات لدها12لدها ولدهب. رابطة حقوق الإنسان النشط تيترامير ويمكن أن تشكل لدها ولدب هوموتيتراميرس وهيتيروتيتراميرس مع بعضها البعض. ويقال لدها أن يكون أعلى النسب بيروفات، بينما يقال لدهب تقارب أعلى لاكتات، وترتبط بشكل تفضيلي بتحويل اللاكتات إلى بيروفات13. مروج لدها يحتوي على مواقع الربط ل HIF1α، كميك و FOXM1 عوامل النسخ11. وباﻹضافة إلى ذلك، مثل العديد من الآخرين الإنزيمات جليكوليتيك14،15، يمكن تعديل رابطة حقوق الإنسان بواسطة التعديلات بوستترانسلاشونال. يمكن فوسفوريلاتي مستقبلات عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 1 لدها Y10، الذي يشجع تشكيل تيترامير، أو Y83، الذي يعزز NADH الركازة ملزمة16. كما يمكن لدها أسيتيلاتيد17. لهذه الأسباب، يتطلب فهم كامل لنشاط رابطة حقوق الإنسان رصد مستويات البروتين رابطة حقوق الإنسان، بل نشاط الإنزيم كذلك.
بالإضافة إلى الأسلوب نحن الحاضرين هنا، استخدمت نهج أخرى لمراقبة نشاط نازعة لاكتات. ويمكن رصد نشاط نازعة لاكتات سبيكتروفوتوميتريكالي في البروتين المتجانس ليستي. توليد NADH كما يتم تحويل اللاكتات إلى بيروفات يمكن أن يقاس استناداً إلى امتصاص في 340 نانومتر، بينما يمكن رصدها في اختفاء NADH كما يتم تحويل بيروفات إلى لاكتات18. وقد تم رصد نشاط نازعة لاكتات أيضا مع التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي). 13 ج-بيروفات يمكن أن تدار وتحويل بيروفات لاكتات يمكن رصدها بنسبة [1-13ج] لاكتات/[1-13ج] بيروفات. ارتفاع نسب [1-13ج] لاكتات/[1-13ج] بيروفات قد لوحظت في أنسجة السرطان19. بينما النهج القائم على التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن أن تقدم معلومات عن النشاط نازعة لاكتات في العادي وأمراض الأنسجة، المنهجيات التي لا تملك القرار بحاجة إلى تحديد مستوى النشاط في الخلايا المحددة. المنهجية المقدمة هنا يمكن تقديم معلومات عن نشاط نازعة لاكتات في مجالات النسيج وحتى في الخلايا المفردة.
استخدام فحوصات النشاط في الموقع ، وجدنا أن نشاط نازعة لاكتات مرتفع في الخلايا الجذعية جريب الشعر من الجلد الماوس20. كما استخدمنا الطريقة لرصد نشاط نازعة لاكتات في استزراع الخلايا الجذعية الجنينية والعثور على النشاط أعلى في الخلايا الجذعية من الطبقة المغذية. وأخيراً، رصد نشاط نازعة لاكتات في الشريان الاورطي الماوس الطازجة ولاحظ تلطيخ في خلايا العضلات الملساء. يصف لنا هنا بروتوكول مفصلة لمراقبة نشاط نازعة لاكتات في الجلد الماوس المجمدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لرصد نشاط نازعة لاكتات أو غيرها الإنزيمات الاستقلابية التي تولد NADH أو نادف، في أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة أو في أجزاء مختلفة من الأنسجة على مر الزمن. لاكتات نازعة إنزيم مهم لفهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والأورام، والقدرة على مراقبة نشاط نازعة لاك…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان HAC الباحث ميلتون هاء كاسل مؤسسة ألن ريتا (http://www.ritaallenfoundation.org). تم تمويل هذا العمل بالمنح إلى HAC من معهد المعهد الوطني ل R01 العلوم الطبية العامة GM081686، R01 AR070245، الوطنية العامة (العلوم R01 GM0866465، إيلي & اديثي مركز واسع للطب التجديدي وبحوث الخلايا الجذعية الطبية روز التلال وغابا Hal جوائز)، تأثير مركز الصحة/جامعة كاليفورنيا كتسي المعاهد الوطنية للصحة منحة UL1TR000124، بمجتمع اللوكيميا اللمفاوية، “المرأة كانتور آيريس” جوائز من مركز السرطان الشامل يونسون أهلا وسهلا و HAC. وأيد البحث عنها في هذا المنشور المعهد الوطني للسرطان من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم P50CA092131. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. HAC عضو إيلي & “أديت مركز واسع للطب التجديدي” & “بحوث الخلايا الجذعية” ومعهد البيولوجيا الجزيئية في جامعة كاليفورنيا و “جامعة كاليفورنيا المعلوماتية البرنامج المشترك بين الإدارات”.
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
Riferimenti
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. . Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).
- Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
- Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
- Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
- Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
- Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
- Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
- Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
- Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
- Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
- Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
- Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
- Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
- Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
- Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
- Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
- Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).
