개미 종 Colobopsis explodens 의 작은 노동자는 가스 크로마토그래피-질량 분석에 의해 이후 용 매 추출 및 분석에 대 한 그들의 hypertrophied 악의 선 저수지에 저장 된 왁 스와 같은 콘텐츠를 분리 해 부. 주석 및 오픈 소스 소프트웨어 MetaboliteDetector를 사용 하 여 휘발성 성분의 식별도 설명 되어 있습니다.
이 원고의 목적은 개미의 보’ 폭발’ Colobopsis cylindrica (COCY) 그룹에 속하는 metabolomic 분석을 설명 하는 프로토콜을 제시 하는 것입니다. 이 위해 모델 종 C. explodens 는 사용된. 작은 노동자 계급에 속하는 개미 독특한 hypertrophied 악의 샘을 (MGs)를 소유한 다. 영토 전투, 그들은 사용 하 여 그들의 확대 악의 선 저수지 (MGRs)의 점성 내용 특성 자살 ‘폭발’ 자발적인 파열에 의해 gastral 외피 (autothysis)의 라이벌 절지동물을 죽 일. 우리가 보여 작업자 개미 왁 스 같은 MGR 내용으로 후속 가스와 거기에 포함 된 휘발성 화합물의 용 매 추출에 필요한 필요한 단계를 나열의 gastral 부분의 절연에 대 한이의 해 부 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 분석 및 추출 물에 포함 된 metabolites의 putative 식별. 해 부 절차와 MGR 내용의 화학 성분의 변화를 최소화 하기 위해 해 부 버퍼 솔루션의 사용 없이 냉각된 조건 하에서 수행 됩니다. 포함 된 휘발성 metabolites의 추출 용 매 기반, 후 사출, 액체, MS, GC를 통해 샘플을 분석 하는 데 필요한 단계는 제공 됩니다. 마지막으로, 데이터 처리 및 오픈 소스 소프트웨어의 사용과 상 상속 대사 산물 식별 MetaboliteDetector 표시 됩니다. 이 방법을 프로 파일링 및 식별에는 COCY에 속하는 개미의 MGRs 휘발성 대사 산물의 GC-MS와 가능 하 게 하는 MetaboliteDetector 소프트웨어를 통해 그룹.
여기에 제시 된 워크플로의 전반적인 목표는 곤충의 분 비에 화학 성분의 일반적인 조사입니다. 이것은 전체적으로 분 비 또는 단일 화합물 그의 생태 역할 elucidating의 기본 목표와 함께 이루어집니다. 또한, 우리는 각각 분 비에서 발견 화합물을 기본 대사 경로 조사 하 고 관심이 있습니다. 개미 (Hymenoptera, Formicidae)에서 특히 동맥 내용을 지금 까지는 미개척된 잠재적으로 bioactive 화합물 (접착제, 항균, 등)1, 의 소스를 제공 하기 때문에 지난 몇 년 동안에서 관심 상승 얻고 있다 2. COCY 그룹3,4 에 속하는 일부 종족의 사소한 작업자 개미 gaster5,6는 mouthparts에서 확장 하는 그들의 hypertrophied MGRs에 포함 된 이러한 화합물을 제공할 수 있습니다. 상 상속 적에 의해 위협 될 때 작은 C. explodens7 의 노동자와 일부 관련 종 만들 수 있는 특이 한 방법으로 그들의 관리자의 사용 내용: 그들은 파열 그들의 gastral 벽의 끈적끈적한 콘텐츠를 추출 하 여 자신을 희생는 MGRs는 상대에 폭발적으로 상 상속 적 억류 되 고 심지어 수 있습니다 그러자 죽을5,6,,89. 개발의 목적 및 본 제시 방법의 사용이 개미 분 비의 가칭 독성 성분의 자연과 화학 성분의 이해를 개선 하는 데 했다.
이 위해, 선물이 그들의 왁 스 같은 MGR 내용 다음 용 매 추출 및 GC-MS 분석의 gastral 부분을 얻기 위해 C. explodens 작업자 개미의 해 부에 대 한 프로토콜.
GC-MS 분석 프로 파일링 및 곤충에서 휘발성 대사 산물 (volatilome)의 식별에 대 한 확고 한 방법 중 하나입니다. 개미에 대 한 관심의 일반적인 analytes cuticular 탄화수소10, semiochemicals11를 포함 하 고 일반적으로, 생물 학적 활동12화합물. 전체 동물 또는 신체 부위 및 곤충13,14의 해 부를 통해 고립 된 체액에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 샘플 준비 기술 포함 용 제14 또는 헤드 스페이스-솔리드-위상-미 (HS-SPME)15의 사용과 거기에 포함 된 metabolites의 추출.
Metabolomic 연구는 샘플 냉동 빠르게 직접 샘플링, 후 화학 성분 및 화합물의 양을 최소화 하기 위해 생명 이다. 이 연구에 대 한 사용 개미 급속 동결 현장 deep-frozen 차가운 팩으로 채워진 멋진 가방에 의해 사망 했다. 샘플 다음 드라이 아이스에 실험실에 수송 되었다 그들은 전에 발전기 구동 전기를 사용 하 여-20 ℃ 냉동 고에 저장 되었다. 여기 해 부 절차로 다른 COCY 종16,,1718전에 완료 되었습니다 전체 개미 나는 gaster는 전체적으로 분석 하지 않고 MGR 내용을 분리 가능성을 제공 합니다. 또한, 제시 프로토콜 또한 수 있습니다 직접 액세스 및 주변 동맥 및 조직, 독 동맥 (VG)5,8, 조용의 선 (DG)8, 또는 다른 생물학 연구에서 또는 내장의 분석 확인 가능한 교차 오염 처리 또는 개미의 해 부 동안에 소개 합니다. 녹고 샘플 또는 화학 물질을 사용 하 여 해 부, 동안 MGR 내용의 화학 성분의 변화를 최소화, 해 부 과정은 최적화에 감기에 팩 (-20 ° C), 어떤 추가 버퍼를 사용 하지 않고 실시 하 세척 솔루션, 또는 용 매입니다. 이 방법을 통해 얻은 샘플은 질적, 양적 질문 적합 합니다.
상 상속 대사 산물 주석 및 식별을 위해 데이터 분석 MetaboliteDetector19, 대사체학 GC-MS 기반 데이터의 자동 분석을 위해 개발 된 오픈 소스 소프트웨어를 통해 이루어집니다. Chromatograms에 단일 이온 봉우리 deconvolution 단계를 수행 하 고 deconvoluted 질량 스펙트럼 분석된 샘플에 포함 된 화합물의 추출 검색. MetaboliteDetector로 화합물의 상 상속 식별은 deconvoluted 질량 스펙트럼의 유사성 뿐만 아니라 결정된 보존 인덱스 (RI, 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 Kovats 리 수)를 기반으로 합니다. RI 및 스펙트럼 일치 요소 (가져올 수 있는, 일반적인 NIST 형식에 있는 경우) 하거나 기존 참조 라이브러리, 또는 설립된 사내 도서관에 대 한 크로스 체크 될 수 있습니다. 어디에 두 개의 독립적이 고 직각 데이터의 최소 식별을 위해 (putative) 화합물, 예를 들어, 여는 화학 분석 작업 그룹 (CAWG) 대사체학 표준 이니셔티브 (MSI)의 지침에 따라 이것이 본격적인 화합물을 기준으로 (여기 보존 시간 (RT) /RI 및 질량 스펙트럼)에서 분석 비 소설 대사 산물 식별20를 확인 하는 필요에 따라 제안 하는 동일한 실험 조건.
COCY 모델 종 C. explodens, MGR에 완전 한 실험을 실시 하지만 절 개 단계 또한 개미 gaster에 다른 샘을 적용할 수 있습니다. 또한, 우리 MGR 콘텐츠를 추출, 설명 하는 워크플로 일반적인 부분의 volatilome의 포괄적인 분석을 위한 프로토콜을 제시 하는 동안 GC-MS 측정 및 데이터 평가 또한 사용할 수 있습니다 분석 (상 상속) 일반적으로 휘발성 metabolites의 식별입니다.
이 원고에 설명 된 실험 곤충에 수행 됩니다, 이후 윤리적 승인이 요구 됩니다. Universiti 브루나이, 브루나이 연구와 혁신 센터 및 브루나이 임업 부, 브루나이 통해이 프로젝트를 통제 하는 지침에 따라 현장 작업, 개미, 게시에 대 한 그들의 사용의 샘플링은 다입니다.
이 원고에서 선물이 volatilome C. explodens 보조 작업자 개미 hypertrophied MGRs 있는 콘텐츠 분석을 위한 완벽 한 프로토콜. 때문에 여기에서 사용 하는 개미 수 ‘폭발’ 집게와 접촉 하는 때 통제 방식에서 MGR 내용을 추출, 곤충 흡 인기 (그림 1)에 의해 제공 하는 ‘소프트’ 컬렉션 기술 사용 하는 것이 좋습니다. COCY 개미를 포함 한 일부 개미 종, 그것 때문에 발생할 수 있습니다 그렇지 않으면 자기는 개미 (예를 들어, 는 headspace에 포 름 산의 축적에 의해)의 중독 개미 50 mL 유리병 당 5 개인의 최대 수를 제한 해야 합니다. 필드에 개미, 동결에 대 한 멋진 가방 deep-frozen 차가운 팩으로 박제를 사용할 수 있습니다. 샘플을 급속 동결 하 고 냉각된 조건 (예를 들어, -20 ° C,-80 ° C에서 최고)에서 저장 한다 하지만 죽 일 때문에 그들의 땀 샘의 공격력이이 방법으로 관찰 되었다 액체 질소에 개미를 저장 하는 권장 되지 않습니다.
제시 버퍼 및 솔벤트 프리 해 부 방법론은 왁 스와 같은 악의 선 저수지 내용 뿐만 아니라 다른 샘 냉동된 노동자 개미에 얻는 적합 합니다. Volatilome C. explodens의 MGR 콘텐츠의 분석을 위해 절 개 하는 동안 고려해 야 할 주요 측면은 개미 (단계 2.1.4)의 연속 냉각 및 다른 선 내용/유체에 MG 샘플의 교차 오염 최소화 개미 gaster (2.5 단계 그림 4및 그림 15). 냉동된 개미의 상당한 부분을 손상 될 수 있습니다, 때문에 개미가 ‘폭발’ 샘플링 하는 동안 또는 실험실에 샘플링 사이트에서 드라이 아이스에 전송 하는 동안 손상 되었다. Gaster 영역이 깨진 경우 이러한 개미 추가 분석 (그림 2C, D)에 대 한 적합 하지 않습니다. 안테나와 다리 인 없거나 깨진 경우에이 개미는 MGR 내용과 추가 분석의 추출에 대 한 여전히 사용할 수 있습니다. MGR 내용의 냉각 C. explodens 개미 스트레이트-앞으로 해 부 바늘 (2.5 단계, 그림 3E, 그림 14)의 사용으로 그들을 분리 하는 왁 스 같은 일관성을 가질. 추가 관리 콘텐츠 스티커 MGR을 처리 하는 동안 수행 될 필요가 있다. 그것은 그것으로 신체 접촉으로 오고 아무것도에 충실 수 있습니다 하 고 또한 종종 다른 샘플의 오염의 위험을 증가 해 부 집게를 준수 합니다. 그것은 해 부 바늘 MGR 콘텐츠를 터치 하 고 즉시 추출 (2.5 및 2.6 단계)에 사용 되는 유리 튜브에 그것을 전송 해야 합니다. 또한, 개미 또는 선 종류 (단계 2.8) 사이 전환할 때 MeOH/H2O 혼합 해 부 장비를 청소 하는 것이 좋습니다.
다른 개미 종 선 내용을 차가운 팩으로 냉각 중에 액체 상태로 존재할 수 있습니다. 이 경우에, 먼저 멤브레인을 포함 한 전체 선 고립 되며 이후에 콘텐츠 구멍. 액체 분 비 미세 모 세관 펫의 도움으로 얻을 수 있습니다. (안테나) 없이 약 4-5 m m의 평균 몸 길이, C. explodens 의 노동자는 COCY 그룹의 작은 종에 속한다. 그들의 자주 부 어 gaster는 약 2-2.5 m m 길이 및 폭에서 1-1.5 m m 구성 되어 있습니다. 그래서 멀리 가장 큰 알려진된 종의 COCY 그룹의 노동자 약 3 m m 길이 및 폭에서 2.5 m m의 gaster 크기 몸 길이 약 8 m m의 크기를 도달할 수 있다. 때문에 프로토콜 잘 해 부 및 개별 개미와 다른 크기의 gasters 조사에 적합 한 COCY 종, 여기 절 개 악기를 사용 하 고 현미경 작은 개미 나 작은 장기에 대 한 적용할 수 있도록 적응 해야 할 수도 있습니다. 또한, 분석 샘플 당 개미의 수 또한 증가 할 수 있습니다.
MGR 콘텐츠에 대 한 개미를 해 부를 하는 동안 그것은 다른 샘 창 자-는 내용의 수 있습니다 크로스-오염 샘플 (단계 2.5, 그림 4 와 그림 15)를 손상 하지 것이 중요. 최적의 경우 DG, MGR 내용의 추출 후 VG 뿐만 아니라 가시 지켜진다 그대로 (그림 4). 아래는 MGRs 있는 DG의 내용으로 오염은 완전히 피하기 어렵다. 이것을 위한 이유는 실험실에 샘플링 사이트에서 드라이 아이스에 전송 하는 동안 선 무결성의 부분 파괴를 포함할 수도 있습니다. 우리는 다양 한 조사 개미에에서 MGR에 대 한 눈치는 DGs 샘플링 하는 동안 또는 폭발, 과정에서 손상 될 가능성 이기도 합니다. 이후는 MGR 목차 (섹션 3, 4)으로 DG 내용을 같은 방법으로 분석 될 수 있다, 결과 MGR 콘텐츠 샘플 (6)의 분석 후 결과 데이터를 비교할 수 있습니다. MGR 콘텐츠 추출 물 C. explodens 개미 로부터 얻은 경우는 DG에도 포함 된 화합물 elute 크로마 (그림 12)에 늦게 시작 합니다. DG 착각을 방지 하기 위해 MGR 성분에 대 한 화합물, 각각 metabolites 추가 분석에서 제외 될 수 있습니다. 다른 개미 종에 대 한 연구에서 그 DGs 또한 포함 될 수 있습니다 (높은) 휘발성 화합물1,24는 일반적으로 초기에 GC 크로마 elute 알려져 있다.
COCY의 MGR 내용의 화학 성분과 상대 하는 이전 연구에서 개미, 전체 개미 또는 그들의 전체 gasters 했다 분석된16,17,,1823, 반면 여기는 MGR 내용 스스로 개미의 절 개를 통해 얻은 했다.
해 부 MGR 내용을 분석 광범위 한 포함 된 metabolites의 식별을 포함 한 생 화 확 적인 연구를 수행 하는 조사 수 있습니다. 이후 여기에 수행된 연구 C. explodens의 MGR에 포함 된 휘발성 성분의 식별에 초점을 맞춘, GC-MS 분석 (제 4)에 대 한 선정 되었습니다. 이 위해 추출 해야 이상적으로 될 준비 후 즉시 측정 또는 분석까지-80 ° C에 저장. 그것은 (확장된) 저장 (3.3-4.2 단계 후 메모 참조) 추출의 화학 변경 될 수 있습니다 주목 해야한다. MGR 내용의 농도 여러 자릿수로의 범위를 커버 수 있습니다, 이후 그것은 다른 GC 분할 비율에 MGR 추출 분석 필요할 수 있습니다. MGR 내용에서 두 가지 주요 화합물 추출 열 과부하 분할의 비율은 2:1 사용 하는 경우 발생 하는 프로토콜을 예시로 이동 하는 개미, 이후이 샘플 높은 분할 비율 50: 1 (단계 4.3.1.2and 그림 5)의 두 번째 시간을 분석 했다. GC-MS 매개 변수 설정 섹션 4에는 재료의 테이블에에서 지정 된 GC MS 디바이스와 생성 된 데이터에 적합 합니다. RI calibrants (4.1.1 단계), 옆 이후의 데이터 분석 중 생물학적 인 인공 물과 오염 물질을 인식 하도 용 매-빈 (4.1.2 단계)를 분석 합니다. 대사 산물 식별, 그것도 정통 표준 샘플 추출 물 (5.4.7and 다음 단계)를 분석 하는 데 사용 같은 GC-MS 조건 주석된 화합물의 측정 하는 것이 중요. 정확성과 최종 데이터의 신뢰성 향상, 동일한 측정 시퀀스 내에서 모든 샘플 카테고리 (용 매-빈, RI calibrants, 샘플 추출 및 표준)을 분석 하는 것이 좋습니다. 또한, 본격적인 표준 샘플 추출에 대 한 관찰에 비해 농도에 분석 되어야 합니다. RI 값 및 샘플 사이의 마지막으로 증가 하 고 더 의미 있는 대사 산물 주석/식별 이어질 것입니다 표준 질량 스펙트럼 유사성의 정확도 향상 시킬 수 있습니다. 이 위해 표준 반복적으로 측정할 수 다른 분할 요소를 사용 하 여.
대사 산물 식별, 정교한 소프트웨어에 대 한 MetaboliteDetector 스펙트럼 deconvolution 및 RI와 스펙트럼 비교 구현된 NIST-라이브러리에도 설립된 사내 도서관 (5)로 사용 됩니다. 그것은 64 비트 리눅스 기반 운영 체제에 (예를 들어, 쿠분투) MetaboliteDetector를 실행 하 고 복사 하 여 생성 된 것이 좋습니다 *. CDF 데이터 파일 (단계 4.4) 로컬 하드 드라이브에 휴대용 데이터 저장 장치에서. MetaboliteDetector는 중심 또는 netCDF 포맷에 원시 GC-MS 데이터를 가져올 수 있습니다. 대부분 GC-MS 장비의 소프트웨어가 형식19에 기록 된 원시 데이터를 변환할 수 있어야 합니다. 데이터 분석을 시작 하기 전에 것이 좋습니다 읽고 문학을 기능과 그래픽 사용자 인터페이스19,25, 이전 MetaboliteDetector 소프트웨어 버전 26.
RI 교정 및 샘플 추출에 복합 봉우리의 후속 RI 값 계산, RIs와 RI calibrants (여기에서, n-알칸)의 스펙트럼을 포함 하는 라이브러리 사용 됩니다. 이러한 라이브러리 중 하나를 수 자체 설립 또는 기존 한 (‘CalibrationLibrary_Alkanes’) 다운로드27일 수 있다. 제공 된 기본 calibrant 라이브러리 RIs 및 n-알칸 C39 C09에서 배열 섹션 4에서 설명한 대로 분석을 위한 스펙트럼을 포함 한다. 제공 된 라이브러리 사용자가 직접 그들의 데이터의 교정 과정을 시작 하는 대사 산물 검출기와 작업을 수 있습니다. 필요한 경우,이 라이브러리는 더 알칸에 대 한 추가 항목 또한 확장할 수 있습니다. 참조 및 실험적으로 파생된 RIs 및 질량 스펙트럼 (5.3 단계와 하위 단계, 그림 7, 그림 8, 그림 9참조)의 유사성을 바탕으로, 주석 또는 화합물의 식별 될 수 있습니다 (5.4 단계 및 하위 단계를 수행 그림 11)입니다. 그것은 또한 그 MetaboliteDetector와 자동화 된 데이터 처리 후 사용자 수동으로 확인 합니다 정확한 피크 따기와 스펙트럼 deconvolution 관심의 putative 각 화합물에 대 한 ‘삼각형’을 기본 질량 스펙트럼을 검사 하 여 중요 한. 또한, GC-MS 계측 및 데이터 생성에 사용 되는 매개 변수 설정에 따라 제시 MetaboliteDetector 설정의 적응은 필요할 수 있습니다. MetaboliteDetector 소프트웨어는.csv, 자동 배치-정량화의로이 원고, 추출 된 이온 전류 (EIC) chromatograms의 예를 들어, 표시, chromatograms의 수출에 설명 보다 많은 유용한 작업을 수행할 수 있는 화합물, 그리고 더 많은입니다.
이 원고에 제시 하는 프로토콜의 분 비 또는 대사 산물 식별 뿐만 아니라 곤충, volatilome 분석에서 선 내용을 격리에 초점을 맞추고 다른 연구자에 의해 수행 하는 실험에 대 한 제안 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
비엔나 과학 및 기술 기금 (WWTF) LS13-048 ISD 통해 얻은이 연구에 대 한 자금. 특별 한 감사 합니다 우리와 함께 보 COCY 개미에 대 한 그녀의 지식을 공유 하기 위한 다이앤 W. 데이비슨 (유타 대학, 지금 은퇴)로 이동 합니다. 우리 쿠 본관 필드 연구 센터 (KBFSC) 및 프로젝트 승인을 위해 Universiti 브루나이 다 루 살람 (UBD)으로 브루나이 임업 부와 브루나이 연구 및 권한 개미를 수집 하기 위해 혁신 센터의 행정 감사 및 승인 하 고 수출 허가의 발급입니다. 특별 감사는 우리의 연구 촉진을 위한 UBD 및 KBFSC 직원, 특히 무하마드 살 레 빈 압둘라 박쥐, 테 디 Chua 꼬마 리, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, 찬 턱 메이, Kushan Tennakoon로 이동 합니다.
Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
Bucket with crushed ice | |||
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
Distilled water | |||
Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
Helium (5.0 – F50) | Messer | 102532501 | |
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |