Les travailleurs mineurs de l’espèce de fourmi Colobopsis explodens sont disséqués afin d’isoler la cireuse de contenu stocké dans les réservoirs de leurs glandes mandibulaires hypertrophiés pour ultérieures d’extraction par solvant et l’analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. L’annotation et l’identification des constituants volatils en utilisant le logiciel open source MetaboliteDetector est également décrite.
Le but de ce manuscrit est de présenter un protocole décrivant l’analyse métabolomique de Bornéo « explosions fourmis » appartenant au groupe Colobopsis cylindrica (COCY). À cet effet, l’espèce de modèle c. explodens est utilisé. Fourmis appartenant à la caste des travailleurs mineurs possèdent des glandes mandibulaires hypertrophiés distinctifs (MGs). Au combat territorial, ils utilisent le contenu visqueux de leurs réservoirs d’hypertrophie de la glande mandibulaire (MGRs) pour tuer les rivaux arthropodes caractéristique suicidaire « explosions » de rupture volontaire du tégument gastrale (autothysis). Nous montrons la dissection des fourmis ouvrières de cette espèce pour l’isolement de la partie gastrale le contenu MGR cireuse comme énumérant les étapes nécessaires requises pour solvant d’extraction des composés volatils qui y sont contenues avec gaz ultérieur chromatographie spectrométrie de masse (GC-MS) analyse et identification putative des métabolites contenus dans l’extrait. La procédure de dissection est réalisée dans des conditions refroidies et sans l’utilisation d’une solution tampon de dissection pour minimiser les changements dans la composition chimique du contenu MGR. Après le solvant d’extraction de métabolites volatils qu’il contient, sont présentés les mesures nécessaires pour analyser les échantillons par liquide-injection-GC-MS. Enfin, traitement des données et l’identification de métabolite putatif avec l’utilisation du logiciel open source MetaboliteDetector est montré. Avec cette approche, le profilage et l’identification des métabolites volatils dans MGRs de fourmis appartenant à la COCY groupe par GC-MS et le logiciel de MetaboliteDetector deviennent possibles.
L’objectif global du flux de travail présentée ici est l’enquête générale des compositions chimiques dans les sécrétions d’insectes. Cela se fait avec le but primaire d’élucider les rôles écologiques de la sécrétion dans son ensemble, ou de simples composés. En outre, nous nous intéressons à enquêter sur les voies métaboliques qui sous-tendent les composés présents dans les sécrétions respectives. Surtout la glande contenu de fourmis (Hymenoptera, Formicidae) ont gagné en hausse des intérêts dans les dernières années, parce qu’ils fournissent des sources jusqu’alors inexplorées composés potentiellement bioactifs (colles, antimicrobiens, etc.)1, 2. les ouvrières mineures de certaines espèces appartenant au groupe COCY3,4 peuvent fournir ces composés contenus dans leurs MGRs hypertrophiés qui s’étendent depuis les pièces buccales au gaster5,6. Lorsqu’il est menacé par des ennemis putatifs, des mineurs travailleurs de explodens c.7 , et certains liés espèces peuvent faire usage de leur MGR le contenu d’une manière inhabituelle : ils se sacrifient par une rupture de leur paroi gastrale pour éjecter le contenu collant de la MGRs explosivement sur l’adversaire, auquel cas l’ennemi putatif est détenu et peut même mourir5,6,8,9. Le but de la mise au point et l’utilisation des méthodes présentées ci-après a été pour aider à améliorer la compréhension de la composition chimique et la nature des constituants toxiques provisoirement de cette sécrétion de fourmi.
À cette fin, nous présentons un protocole pour la dissection des fourmis ouvrières c. explodens d’obtenir la portion gastrale de leur contenu MGR cireuse avec ultérieures d’extraction par solvant et l’analyse par GC-MS.
Analyse par CPG-SM est une des méthodes bien établies pour le profilage et l’identification des métabolites volatils (volatilome) contre les insectes. Analytes typiques d’intérêt à fourmis incluent hydrocarbures cuticulaires10, écomones11et en général, les composés avec activité biologique12. Échantillons peuvent être obtenus des animaux entiers ou des parties du corps et liquides isolés par dissection des insectes13,14. Techniques de préparation d’échantillon comprennent l’extraction des métabolites qui y sont contenues avec l’utilisation de solvants14 ou feuillure-solide-microextraction en phase (HS-SPME)15.
Pour les études métabolomiques, il est vital que les échantillons sont congelés rapidement directement après le prélèvement, afin de minimiser les changements dans la composition chimique et la quantité des composés. Les fourmis utilisées pour cette étude ont été tués par la congélation rapide sur place dans un sac isotherme farcie surgelées compresses froides. Les échantillons sont ensuite conservés dans un congélateur à-20 ° C à l’aide axée sur le générateur d’électricité, avant ils ont été transportés au laboratoire sur la glace sèche. La procédure de la dissection présentée ici offre la possibilité d’isoler le contenu MGR sans analyser la fourmi entier ou le gaster dans son ensemble, comme cela a été fait avant pour différents COCY espèces16,17,18. En outre, le protocole présenté permet également un accès direct et l’analyse des glandes et des tissus, comme le venin glande (VG)5,8, glande (DG)8 du Dufourou les intestins dans d’autres études biologiques, ou à environnants Recherchez les contaminations croisées Croix possibles a présenté au cours de la manipulation ou la dissection des fourmis. Pour minimiser les changements dans la composition chimique du contenu MGR au cours de la dissection, dégel des échantillons soit par l’utilisation de produits chimiques, le processus de dissection a été optimisé pour être effectué sur une compresse froide (-20 ° C), sans l’utilisation de n’importe quel tampons supplémentaires, solutions de lavage, ou solvants. Les échantillons obtenus par cette méthode sont adaptés pour répondre aux questions qualitatives et quantitatives.
Analyse des données aux fins d’identification et annotation de métabolite putatif se fait via le logiciel open-source MetaboliteDetector19, qui a été développé pour l’analyse automatique des données de métabolomique basée sur GC-MS. Il détecte seul ion pics présents dans les chromatogrammes, effectue une étape de déconvolution et extraits déconvoluées spectres de masse des composés chimiques contenus dans les échantillons analysés. Putative identification de composés organiques MetaboliteDetector repose sur l’indice de rétention déterminée (RI ; le peut de Kovats RI calculés automatiquement par le logiciel) ainsi que de la similitude des spectres de masse déconvoluées. RI et facteur spectral match peuvent être une vérification croisée contre deux bibliothèques de référence existants (qui peut être importés, si elles sont dans le format commun de NIST) ou une bibliothèque interne établie. C’est conformément aux lignes directrices pour les (présumée) composé d’identification a suggéré, par exemple, par la de la métabolomique Standards Initiative (MSI), chimique analyse Working Group (CAWG) où un minimum de deux données indépendantes et orthogonales par rapport à un authentique composé (ici la rétention temps /RI (RT) et spectre de masse) analysé sous des conditions expérimentales identiques sont proposées au besoin pour confirmer pas nouveau métabolite identifications20.
L’expérience complète est réalisée sur le contenu MGR de l’espèce de modèle COCY c. explodens, mais les étapes de la dissection peuvent aussi être adaptées pour isoler les autres glandes présentes dans le gaster de fourmi. En outre, tandis que nous présentons un protocole pour l’analyse globale de la volatilome du contenu MGR, les pièces plus génériques du flux de travail décrivant l’extraction, GC-MS mesurage et évaluation des données permet également l’analyse et la (présumée) identification des métabolites volatils en général.
Puisque les expériences décrites dans ce manuscrit sont effectuées sur les insectes, aucune approbation éthique n’est nécessaire. Travail sur le terrain, l’échantillonnage des fourmis, ainsi que leur utilisation pour la publication sont conformément aux directives régissant ce projet par le biais de l’Universiti Brunéi Darussalam, la recherche du Brunei et Centre d’Innovation et de Brunei Forestry Department, Brunei Darussalam.
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet pour l’analyse de la volatilome du contenu trouvé dans les RGM hypertrophiés des ouvrières mineures c. explodens . Puisque les fourmis utilisées ici pourraient « exploser » et éjecter de leur contenu MGR de manière incontrôlée quand ils sont touchés avec une pince, il est recommandé d’utiliser une technique de collection « douces » comme prévu par un aspirateur d’insectes (Figure 1). Pour certaines espèces de fourmis dont les fourmis COCY, il peut être nécessaire de limiter le nombre maximal de fourmis à cinq individus par flacon de 50 mL, car sinon intoxication des fourmis (p. ex., par accumulation de l’acide formique dans l’espace de tête) peut-être survenir. Pour congeler les fourmis dans le champ, un sac isotherme farci avec des compresses froides surgelés peut-être être utilisé. Les échantillons devraient être rapidement congelés et stockés dans des conditions de refroidissement (par exemple, -20 ° C, les meilleures à-80 ° C), mais il n’est pas recommandé de tuer et de stocker les fourmis dans l’azote liquide, car on a observé une augmentation des dommages de leurs glandes avec cette méthode.
La méthodologie de la dissection présentée tampon – et sans solvant convient pour obtenir le contenu du réservoir cireuse glande mandibulaire, mais aussi des autres glandes présentes dans les fourmis ouvrières congelés. Volatilome analyse de la teneur MGR de explodens c., principaux aspects à considérer lors de la dissection sont un refroidissement continu de la fourmi (étape 2.1.4) et minimiser les contaminations croisées entre des échantillons MG avec d’autres matières de glande/liquides présents dans le gaster de fourmi (étape 2.5, Figure 4et Figure 15). Une fraction considérable des fourmis congelés peut-être être endommagée, soit parce que les fourmis « explosé » lors de l’échantillonnage ou ont été endommagés pendant le transport sur la neige carbonique sur le site de prélèvement d’échantillons au laboratoire. Si la région de gaster est cassée, ces fourmis ne conviennent pas pour une analyse ultérieure (Figure 2, D). Si seulement les antennes et les pattes sont manquantes ou brisées, ces fourmis pourront encore être utilisés pour l’extraction du contenu MGR et une analyse plus approfondie. Étant donné que le contenu MGR de refroidi par explodens c. fourmis ont une consistance cireuse, il est simple de les isoler avec l’utilisation d’aiguilles de dissection (étape 2.5, Figure 3Eet Figure 14). Soins supplémentaires doivent être prises lorsque vous maniez le collant MGR contenu. Il peut s’en tenir à tout ce qui vient en contact physique avec elle et respectera également souvent à la pince de dissection, ce qui augmente le risque de contamination des autres échantillons. Il faut seulement toucher au contenu MGR avec l’aiguille de la dissection et de transférer immédiatement dans les flacons de verre utilisés pour l’extraction (étapes 2.5 et 2.6). En outre, il est recommandé de nettoyer le matériel de dissection avec un mélange de2O MeOH/H lors du basculement entre les fourmis ou glande-types (étape 2.8).
Contenu de la glande d’autres espèces de fourmis peut-être être présents à l’état liquide même pendant le refroidissement avec compresses froides. Dans ce cas, la glande entière, y compris la membrane peut d’abord être isolée et perforée par la suite pour obtenir le contenu. Sécrétions de liquides peuvent également être obtenues à l’aide de pipettes capillaires fines. Avec une longueur moyenne d’environ 4-5 mm (sans antenne), travailleurs de explodens c. appartiennent à des espèces plus petites du groupe COCY. Leur gaster souvent gonflée comprend environ 2 à 2,5 mm de longueur et 1 à 1,5 mm de largeur. Travailleurs des espèces connues pour autant plus grandes du groupe COCY peuvent atteindre une taille d’environ 8 mm de longueur de corps avec une taille d’environ 3 mm de long et 2,5 mm de largeur de gaster. Étant donné que le protocole est bien adapté pour disséquer et étudier les fourmis et gasters de cette taille de différentes espèces de COCY, ici utilisaient des instruments de dissection et microscope peut-être devoir être adapté pour s’appliquer aux petites fourmis ou petits organes. En outre, le nombre de fourmis par échantillon d’analyse peut-être d’augmenter aussi bien.
En disséquant la fourmi pour le contenu MGR, il est critique ne pas d’endommager les autres glandes ou les intestins – dont le contenu peut croisée l’échantillon (étape 2.5, Figure 4 et Figure 15). Dans le cas optimal, après l’extraction du contenu MGR, le DG, ainsi que le VG sont visiblement gardé intact (Figure 4). Des contaminations par le contenu de la DG, qui se trouve sous les RGM, sont difficiles à éviter complètement. Raisons pour cela peuvent également inclure l’interruption partielle de l’intégrité de la glande au cours du transport sur la neige carbonique sur le site d’échantillonnage au laboratoire. Il est également possible que les DG sont endommagés lors de l’échantillonnage ou en train d’exploser, comme nous avons remarqué pour le MGR dans un certain nombre de fourmis étudiés. Étant donné que le contenu de la DG peut être analysé de la même manière comme le MGR Sommaire (Sections 3 et 4), les résultats peuvent être comparés aux données résultantes après analyse des échantillons contenus MGR (Section 6). Dans le cas de MGR contenus extraits de c. explodens fourmis, les composés figurant également dans la DG commencent à éluer tard dans le chromatogramme (Figure 12). Pour éviter de confondre DG composés pour les constituants MGR, les métabolites respectifs peuvent être exclus de l’analyse. D’études sur les autres espèces de fourmis, il est connu que DGs peuvent également contenir des composés volatils (très)1,24, qui généralement éluer au début de la GC-chromatogramme.
Dans des études antérieures portant sur la composition chimique du contenu MGR de COCY fourmis, fourmis entières ou leurs gasters entiers étaient analysées16,17,18,23, tandis que contenu ici le MGR eux-mêmes ont été obtenues par l’intermédiaire de dissection des fourmis.
Analysant disséqués MGR contenu permet aux enquêteurs effectuer un large éventail d’études biochimiques, y compris l’identification des métabolites qui y figurent. Étant donné que l’étude réalisée ici axée sur l’identification des constituants volatils contenus dans le MGR de c. explodens, GC-MS a été choisi pour son analyse (Section 4). Pour ce faire, les extraits doivent idéalement être mesurés immédiatement après la préparation ou conservés à-80 ° C jusqu’à l’analyse. Il est à noter que le stockage (étendu) peuvent entraîner des altérations chimiques des extraits (voir les Notes après les étapes 3.3 et 4.2). Étant donné que la concentration du contenu MGR peut couvrir une gamme de plusieurs ordres de grandeur, il peut être nécessaire d’analyser les extraits MGR à différent GC fractionner les ratios. Étant donné que les deux principaux composés dans le contenu MGR extrait des fourmis pris pour illustrer le protocole due colonne surcharge lorsqu’un rapport de 2:1 split a été utilisé, cet échantillon a été analysé une deuxième fois à un ratio plus élevé de la scission de 50 : 1 (étape 4.3.1.2and Figure 5). Les GC-MS des paramètres présentés à la Section 4 conviennent aux données obtenues avec les appareils de la GC-MS spécifiés dans la Table des matières. À côté de la RI calibrants (étape 4.1.1), un solvant-blanc (étape 4.1.2) devrait également être analysé afin de reconnaître les artefacts non biologiques et contaminants pendant l’analyse ultérieure des données. Pour l’identification des métabolites, il est aussi important de mesurer les normes authentiques de composés annotés dans les mêmes conditions de GC-MS que celui utilisé pour analyser les extraits d’échantillons (suivant étapes à 5.4.7and). Afin d’améliorer l’exactitude et la fiabilité des données finales, il est recommandé d’analyser au sein de la même séquence de mesure sur toutes les catégories de l’échantillon (solvant-blank, RI calibrants, extraits d’échantillons et les normes). En outre, les normes authentiques doivent être analysées à une concentration comparable à celle observée pour les extraits d’échantillons. Cela permet d’améliorer l’exactitude des valeurs de RI et la similitude entre l’échantillon et les spectres de masse standards, qui mènent finalement au métabolite accrue et plus significative annotation/identification. À cette fin, les normes peuvent être à plusieurs reprises mesurés à l’aide de facteurs différents split.
Pour l’identification des métabolites, le logiciel sophistiqué, MetaboliteDetector est utilisé pour la comparaison de déconvolution et RI et spectres de spectres à une mise en œuvre NIST-bibliothèque ainsi qu’une bibliothèque interne établie (article 5). Il est recommandé d’exécuter le MetaboliteDetector sur un 64 bits basé sur LINUX système d’exploitation (p. ex., KUBUNTU) et de copier le produit *. Fichiers de données CDF (étape 4.4) depuis le périphérique de stockage de données portable sur le disque dur local. MetaboliteDetector est capable d’importer des fichiers RAW au format netCDF centroïde ou profil GC-MS. Le logiciel de la plupart des instruments de GC-MS devrait être en mesure de convertir les données brutes enregistrées dans ce format19. Avant de commencer l’analyse des données, il est fortement recommandé de lire la documentation disponible pour les versions précédentes du logiciel MetaboliteDetector pour vous familiariser avec les fonctionnalités et l’interface utilisateur graphique19,25, 26.
Pour l’étalonnage de RI et calcul de la valeur RI subséquente des pics composés présents dans les extraits d’échantillons, une bibliothèque contenant les RIs et les spectres des calibrants RI (ici, n-alcanes) est utilisée. Cette bibliothèque peut être autonome établie, ou un préexistant (« CalibrationLibrary_Alkanes ») peut être téléchargé27. La bibliothèque de degré par défaut fourni contient RIs et spectres pour les n-alcanes allant de C09 à C39 qui ont été analysées comme décrit à la Section 4. La bibliothèque fournie permet aux utilisateurs qui travaillent avec détecteur de métabolite de commencer directement par le processus d’étalonnage de leurs données. Si nécessaire, cette bibliothèque peut être étendue avec des entrées supplémentaires pour les autres alcanes. Annotation ou l’identification des composés basés sur la similitude de référence et les RIs expérimentalement dérivées et les spectres de masse (voir étape 5.3 et les étapes intermédiaires, Figure 7, Figure 8, Figure 9), peut être réalisée (étape 5.4 et sous-étapes, La figure 11). Il est également crucial qu’après traitement automatisé des données avec MetaboliteDetector, l’utilisateur vérifiera manuellement pour pic bonne cueillette et spectre déconvolution en inspectant les spectres de masse qui sous-tend le « triangle » pour chaque composé putatif d’intérêt. En outre, selon l’instrumentation GC-MS et les paramètres utilisés pour la génération de données, les adaptations des paramètres MetaboliteDetector présentés peuvent être nécessaires. Le logiciel MetaboliteDetector est capable d’effectuer de nombreuses opérations plus utiles que l’expliquer dans ce manuscrit, par exemple, l’affichage des chromatogrammes (EIC) actuels d’ion extrait, exportation des chromatogrammes comme .csv, lot-quantification automatique des composés et bien d’autres.
Le protocole présenté dans ce manuscrit peut servir de suggestion pour les expériences réalisées par d’autres chercheurs, en se concentrant sur l’isolement des glandes ou contenu de la glande d’insectes, volatilome analyse, ainsi que d’identification métabolite.
The authors have nothing to disclose.
Financement de cette étude a été obtenue par le biais de la Vienne Science et Technology Fund (WWTF) LS13-048 pour la DSI. Remerciements spéciaux à Diane W. Davidson (Université de l’Utah ; maintenant la retraite) pour nous faire partager ses connaissances sur les fourmis Bornean COCY. Nous apprécions les administrations de le Kuala Belalong Field Studies Center (KBFSC) et Universiti Brunei Darussalam (UBD) d’approbation du projet ainsi que du Brunei Département des forêts et du Brunei recherche et Centre d’Innovation pour obtenir la permission de recueillir des fourmis et approbation et délivrance de permis d’exportation. Remerciements spéciaux à DLUO et KBFSC personnel, notamment Mohammed Salleh bin Abdoullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei et Kushan Tennakoon pour faciliter nos recherches.
Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
Bucket with crushed ice | |||
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
Distilled water | |||
Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
Helium (5.0 – F50) | Messer | 102532501 | |
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |