ボルネオから下顎腺貯留層内容の分離 ' GC MS と MetaboliteDetector による Volatilome 解析のためアリの (守) を爆発

1. アリのコレクション 吸引装置 (図 1) を用いるマイナーな働きアリを収集します。 サンプリング、直後に-20 ° C で急速凍結によってアリを修正し、解析まで低温で保管します。 2. MGR 内容とアリから DG の分離 アリの解剖の前に次の準備をします。 きれいにガラス シャーレとメタノール-水混合物 (メタノール/H2O; 1 + 1 v/v) と組織郭清の楽器。注意: メタノールは人間に有毒であります。常に適切な手袋、白衣、ゴーグルを着用し、ヒューム フードの下でクリーニングを実行します。 冷たいパック、ガラス シャーレに-20 ° C を凍結します。 シリコーン/ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 隔壁を有するスクリュー キャップを含む 1.5 mL 短いスレッド バイアルの大衆を決定し、直接顕微鏡の横にある氷のそれらを保ちます。注: サンプル バイアルの選択はオプションです。ここでは、MGR 内容はガラス製冷却 1.5 mL バイアルに直接配置されます。プラスチックは、ターゲット代謝物の信号に干渉するアーティファクトを引き起こす可能性のある化合物 (フタル酸エステル類など) を含めることができます。 押し出し発泡スチロール製の箱に冷凍の冷たいパックを配置します。冷たいパックの上にペトリ皿を置くし、皿に冷凍アリを入れてください。ステレオの顕微鏡の下のボックスをマウントします。全体のアリを明確に見ることができるまで、倍率 (20-40 倍) とフォーカスを調整します。 その gastral のコンパートメントの完全性の冷凍の ant をチェックします。解剖、そのままガスター領域 (図 2 aB) とアリだけを取る。フラット gasters またはさらに分析 (図 2D) から自分の身体の表面硬化の MGR コンテンツの痕跡アリを除外します。 細い鉗子、同属での 1 つのペアを選択した ant をつかむ (最初の腹部のセグメント) と葉柄 (腹部第 2 セグメント) で鉗子の他のペア。優しく ant 体 (図 3 a) の残りの部分から引き離し、ガスター地域をデタッチします。 4 節背板で細い鉗子で保持することによって今区切られた ant ガスターを修正します。細い鉗子の別のペアの横にある、葉柄) 1 節背板をつかむし、(図 3 b) を剥がしてそれを慎重に取り外します。Tergites 2 および 3 (図 3、D) gastral 部分まで、MGRs のもこの手順を繰り返します ( C. explodens働きアリの黄色が、MG コンテンツの色黄色の上の他の種が赤に白から範囲) は最も目に見える部分。注: 外骨格を外して、MGR の膜も一部削除されます。 解剖針を用いて、やさしく gastral コンパートメント (図 3E) それらをスクラッチでペア MGRs のワックスのような内容を削除します。Ant ガスターで現在他の腺を破裂せず分離することができます MGR コンテンツのそれらの部分を削除だけです。多くの力や努力は全体として MGR コンテンツの取得に適用される必要がある、その不完全な除去 (図 4) を受け入れます。 彼らはそれに固執するまで解離針の先端でそれらに触れて優しくで MGR 内容を拾います。知られている冷却 1.5 短いスレッド バイアルに MGR 内容を転送風袋質量。 解剖針の先端から粘着性の MGR の内容を削除するには、サンプル瓶の壁に針の先端を移動し、壁にそれらを中傷します。バイアルを閉じて次の MGR 内容が分離まで、氷の上に配置します。 後で隣接する DG (セクション 6) 由来化合物によるコンテンツの MGR のサンプルの可能な交差汚染のチェック、また蟻のまま (図 4) が彼らであり、別の高速液体クロマトグラフィー バイアルに入れてから DGs を収集します。 ペトリ皿とメタノール/H2O 解剖器具を常に清潔 (1 + 1 v/v)、腺の腺または ant からアリに変更するとき。 1 つの分析試料の貯蔵所の内容または複数アリの腺を組み合わせます。注: 腺またはその内容を 1 つの分析試料の使用数は実験デザインによって異なります。ここでは、MGR 内容または 5 アリの DGs のいずれかを 1 つの分析試料を取得する集めた。 3. 分離腺内容の溶媒抽出 (ここで、MGR 内容または 5 アリからプール隣接する腺) 分析試料の質量を決定します。 1:14 の比が一定で冷たい純度の高い酢酸エチル (エチル) を追加 w/v と渦冷却条件の下で 5 分間サンプルここでは、恒温室で 7 ° C で実行されます。 7 ° C で 3,820 × g で 10 分間のサンプルを遠心し、培養上清を転送 (5 アリから得られた MGR コンテンツ抽出物の約 55-75 μ L) 1.5 mL の予冷に短いスレッド バイアル含む 0.1 mL のマイクロ チップ。しっかりとスクリュー キャップの穴と赤いゴム/テフロン隔壁を含むとバイアルにシールします。分析はすぐに実施することはできない場合、注意: 抽出-80 ° c まで凍結/融解サイクル中に化学変化のリスクを最小限に抑えるため作製直後にサンプルを分析する分析が、それを推奨します。 4. GC-MS 完全な GC MS 測定シーケンスのそれぞれ 1.5 mL 短いスレッド バイアルに以下のソリューションを準備します。 8 mg/L の化合物ごとの最終的な集中に市販のアルカンの標準溶液を希釈することによって RI calibrant の混合物を準備ヘキサンを使用しています。 溶媒ブランクを準備純粋なエチルから成る。 1) 溶剤の空白、3) MGR の内容、2) RI calibrant 混合物を含むバイアルを抽出、場所、4) DG 内容をガスクロマト グラフ (GC) と結合したオートサンプラーの冷却トレイ (10 ° C) に抽出します。注: オートサンプラ、測定前に各バイアルを保持期間を最小限に抑えることをお勧めします。MGR のコンテンツのサンプルのような重要なサンプルのバイアルは、オートサンプラ、解析の前にすぐに置かれるかもしれません。 各サンプルでは、ターゲット化合物の適切な列にクロマト グラフ分離の GC MS に 1 μ L 分注を注入 (ここで: HP-5 MS UI 列)。 適切な GC パラメーターは、以下のように設定します。 キャリアガスとしてヘリウムを使用し、1 mL/分 40 ° C から始まって 2 分、最大 10 ° C/分のランプに続いてホールド オーブン温度ランプ 330 ° C、7 分のホールド時間 270 ° 入口温度設定セットの定数の列の流れを設定C. 選択、必要な場合、十分なピーク形状は、GC-MS 射出用の分割比率と関心 (図 5) の化合物の強度を調整します。注: 例で提示された必要だった DG の抽出物は分割比率 2:1 とスプリットレス モードで RI calibrant の混合物を測定します。分割比率 2:1、2 回目 50: 1 で MGR のコンテンツ抽出を行った。 補助の温度を 350 ° C に設定します。 質量分析計 (MS) のパラメーターを次のように設定: MS 源泉温度 230 ° C、4.1 (溶媒ブランクと実験的サンプル) のための分または (RI calibrant の混合物) の 6.1 分遅くなる MS クワッド温度 150 ° C、高質量 500、溶剤に低質量 30 からスキャン範囲、それぞれ。スキャン レートを約 3 スキャン/秒に設定します。注: MS のパラメーター、特に、MS スキャン、サンプリング レート、サイクル時間ピーク ピッキングとスペクトル ・ デコンボリューションに影響を与える可能性があり、MetaboliteDetector ソフトウェアと適切なデータ評価のためのパラメーター設定を選択するときに考慮しなければなりません。 測定が完了すると、データをエクスポートします。AIA プロジェクト ファイル (GC 付属データ解析ソフトウェアを使ってここで実行されます) ポータブル データ ストレージ デバイス。 ファイルを選択 |… AIA 形式にデータをエクスポート作成新しいディレクトリをチェックし、 [ok]をクリックします。募集ストレージの場所 (例えば、USB フラッシュ ドライブ) を選択し、開くをクリックします。エクスポートして—>アイコンをヒットするファイルを選択します。プロセスをクリックするとを確認します。 5. 代謝物の検出と MetaboliteDetector ソフトウェアの使用との識別 MetaboliteDetector を開くデータ ファイルの分析を開始する前に、ツールを選択 |設定、(MetaboliteDetector の個々 のシートは、太字で示してあります) 次のように必要なパラメーターを設定。 シート外観で分にタイム スケールを設定し、軸ラベル] オプションを有効にします。 デコンボリューションシートでピーク設定をするためのパラメーターを設定: ピークしきい値: 10、および最小ピーク高さ (ノイズ ユニット): 10。ベースラインの調整を有効にするチェック ボックスをオフします。代謝産物の検出するためのパラメーターを設定: ビン/スキャン: 10、デコンボリューション幅 (スキャン): 5、所要強度 (基本ピークの %): 0、および必要な数のピークの: 10。 識別シートでライブラリの検索オプションを設定: 化合物ライブラリ: ‘CalibrationLibrary_Alkanes’ と nist (NIST sqlite ライブラリは、.lbr 形式で含まれることができます)。パラメーターを次のように設定: 最大。RI の違い: 10、カットオフ スコア: 0.9、ピュア/不浄組成: 0.5 の場合、フラグメント数: 同一 frag の 2、最小数: 1。 使用スケール lib: カチカチ音をたてた。類似性スコア: 仕様の類似性;大容量フィルター: m/z (の GC カラムの固定相から生じる知られている汚染物質) 1147、355、281 221 207。 シートで定量化パラメーターを設定: 定量イオン数: 3、その後イオン間距離: 5 と最低限必要な品質インデックス: 1。 1147、355、281 221 207 定量イオンを除外します。メモ: 高分解能 MS データ、場合さらに以下のパラメーターで設定シートに重心: ピークしきい値を開始: 10、ピークのしきい値の終わり:-5 と最大基準距離: 30、半値幅: 0.5。 ファイルをインポートします。CDF 形式内に生成されます。AIA プロジェクト ファイルとして。ファイルを選択して MetaboliteDetector ソフトウェアに NetCDF |インポート |NetCDF インポート。フォルダーの形をしたアイコンを選択し、インポートおよび処理するサンプル カテゴリのファイルを選択: 1) 溶媒ブランク、2) RI calibrants、3) MGR コンテンツ抽出、4) DG コンテンツ抽出。データの処理を開始する[ok]で確定します。処理後、表示されるウィンドウで閉じるを選択します。 RI 校正と MGR エキスに含まれている化合物の RI 値の決定は、ファイルを選択 |オープンRI calibrants のデータを含むファイルを選択します。 RI calibrant ファイルが開かれた後は、虫眼鏡のアイコンを選択します。Ok ボタンでウィンドウが表示されてを確認します。 適切な RI の校正、RI calibrant ファイルで検出可能なアルカンの範囲を確認してください。 このため、それを一度クリックして (最低の RT では、図 6) で検出可能なアルカンの最初から発信された、最初のピークの最大の下に表示される三角形を選択します。 スペクトルの類似性が最も高いヒットをチェック (‘ 仕様 sim.’, 最大スコア = 1) アルカン ライブラリ エントリ (図 6) と比較して。 推奨されるアルカン化合物の id を確認するには、文学、例えば、 NIST 化学 WebBook22で与えられた質量スペクトルにその質量スペクトルを比較します。 最後のクロマト グラムで表示されるアルカン ピークを数えることによって最後のアルカン RI calibrant 混合物中に検出を確認します。 RI 校正用ツールを選択 |RI チャンネルキャリブレーション ウィザード。次を選択します。 フォルダーの形をしたアイコンにクリックし、RI calibrant 混合物のクロマト グラムを含むファイルを選択します。次を選択します。 [出演] ウィンドウでアルカン calibrants のエントリを含むライブラリを選択します。 RI calibrant ファイルで検出可能なすべてのアルカンのライブラリ エントリを選択し、クリックして、 >>アイコン。選択した後>>、次を選択します。 RTs の出現テーブルに各検出アルカンの記載を確認してください。このため、それぞれの三角形 (図 7) をクリックして各アルカンのメイン ウィンドウに描かれている RTs をチェックします。キーボード (の助けを借りて、RT にドロップ ダウン メニューを選択して RT。 また、正しい提案を入力必要 (図 8) にそれぞれのフィールドをダブルクリックして手動でキャリブレーション テーブルで RT が解決しない場合図 9)。 各アルカンの RT が正しい場合は、次を選択します。次の RI キャリブレーション テーブルを示すウィンドウが表示されてクリックします。 クロマト グラムの選択ウィンドウが表示されて、緑+シンボル、抽出溶媒ブランクのデータ ファイルと腺のファイルを選択し、次選択します。[パラメーター設定ウィンドウが表示されて次のように: しきい値をピークのベースラインの調整を無効にする、: 5、最小ピーク高さ: 5、箱/スキャン: 10 とデコンボリューション幅: 5次とヒットし、開始の RI の計算を実行するには。選択したサンプル ファイルに含まれている化合物。 アノテーションは、MGR 抽出で選ばれた代謝物の同定を RIs を (ステップ 5.3.9)、上記のように計算されている測定の MGR コンテンツ抽出のデータ ファイルを開くファイルを選択する |オープン募集データ ファイルを選択するとします。 ツールを選択 |設定 |デコンボリューション、最小ピーク高さ (ノイズ ユニット) 両方と同様、ピークのしきい値を 5 に変更します。虫眼鏡アイコンを選択し、 [ok]をもう一度警告ウィンドウが表示されてを確認します。 最大の関心のピークの下に表示される三角形の上にクリックし、 NISTアイコンを選択して NIST ライブラリに格納されているものとその質量スペクトルを比較します。 NIST 検索 (図 10) の最初の結果ヒットを選択します。 興味の化合物の結果のスペクトルの類似性は、選択したスペクトルの類似性スコアを超えている場合 (ここで 0.9) (GC の列、膜厚、および列のような固定相の RI を見て NIST エントリ (図 10) に比べると、直径) (例えば、 NIST 化学 WebBook22) の文献でこの化合物の与えられました。 実験的派生 RI NIST 参照 RI (または複数の RI 値が与えられたときの平均の RIs) の相対的な差を計算します。差が等しいまたはユーザーが指定した最大許容値未満 (ここで ≤ ± 1%)、指定として化合物 ‘ 付きます」。 MGR のサンプル ファイルに含まれる興味のすべての化合物の 5.4.2–5.4.5 の手順を繰り返します。 化合物を同定、RI と標準溶液の質量スペクトルを比較 (例えば2-100 mg/L) 注釈付きの化合物のセクション 4 で説明されているように、同じ条件下で測定します。 セクション 4 で説明したように標準を分析し、前述のアルカンと手順 4.4 と 5.2 で MGR コンテンツ腺データ結果のデータを処理します。 ツールを選択して、標準から取得したデータを校正 |RI チャンネルキャリブレーション ウィザード |次前に使用したのと同じ RI calibrant ファイルを選択するとします。再度次と選択データを含むファイルから取得した標準液グリーン+のシンボルをクリックして、次を選択します。次とヒットし始める標準化合物の RI を計算します。注: 標準の分析は、サンプル分析の後すみやかに実行できない場合、勧め RI calibrants をもう一度分析して標準の新しい RI の校正および計算を実行します。 標準のそれぞれのファイルを開き、5.4.2 の手順で説明したように、NIST ライブラリとそのスペクトルの比較によってその身元を確認します。 標準のアイデンティティの確認の後館内の図書室に質量スペクトルと化合物の標準の RI を追加します。このため、グリーン+シンボルをクリックし、ライブラリ エントリの優先する名前を入力します。化合物ライブラリの標準の RI と質量スペクトルを追加する[ok]を確認します。ライブラリに新しいエントリを見ることができない、する場合は、更新ボタンをアクティブにします。注: RI キャリブレーションが正常に実行された場合 MetaboliteDetector によって決定 RI 表示されますそれぞれのライブラリのエントリで。標準のライブラリのエントリを作成すると、RI の組み合わせに基づく MG 抽出でこの代謝物の同定、スペクトルの類似性があります。 MGR コンテンツ データ ファイルを再度開きます。ツールを選択 |設定 |識別。今、標準化合物の RI は、計算され、ライブラリのエントリを追加と、スコアの結合にスペクトルの類似性から類似性スコアを変更します。 虫眼鏡のアイコンをクリックし、手順 5.4.5 でアノテーションされている化合物の下に三角形を選択します。 ヒットにクリックし、’全体的な類似性スコア’ に指定された値を確認 (OSS、’全体の類似 ‘として代謝産物の検出器によって省略)、スペクトルの類似性と RI の類似性の組み合わせを考慮したスコア (図 11)。注: ヒットは、館内の図書室で発見された場合、メイン ウィンドウの右側にあるに表示されます。 OS がユーザー定義のしきい値 (ここ ≥ 0.9、三角形の緑の色によっても示されます) を超える場合、指定化合物 ‘識別’ (図 11)。 6. DG コンテンツによって汚染の MGR コンテンツ抽出物のチェック MetaboliteDetector (ステップ 5.3.9) を持つ化合物の RIs がすでに計算されて DG サンプルの校正のファイルを開きます。 MG コンテンツのサンプルと DG サンプルの測定後に得られたクロマト グラムのオーバーレイ、ツールを選択 |クロマト グラムのオーバーレイグリーン+アイコンを介して 2 つのそれぞれのファイルを選択します。Ok ボタンで決定します。 オーバーレイを表示するには、ウィンドウの下部に表示されるクロマト グラムのオーバーレイシートを選択します。 MGR コンテンツ間の物質の重複チェックを抽出 (図 12) と DG のコンテンツを抽出し、さらに MGR のコンテンツ分析から重複する化合物を除外します。