Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.
Microglia beyin homeostazı katılmak ve sürekli çevreleri disfonksiyon, yaralanma ve hastalık için anket beyin fagositler vardır. İlk müdahale olarak microglia nöron ve glia fonksiyon bozukluğu azaltmak için önemli işlevleri vardır ve bu süreç içinde onlar çok çeşitli morfolojik değişiklikler tabi. Microglia türleri morfoloji açıklayıcı kategorize edilebilir veya alternatif olarak, hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekil gibi parametreleri için sürekli bir değişken olarak sayılabilir. Tek Kişilik hücrelere microglia miktarının yöntemleri uygulanırken, tüm bir photomicrograph içinde birden çok microglia birkaç teknikleri uygulamak. Bu yöntemin amacı çoklu ölçmek etmektir ve tek hücreler hazır ImageJ protokolleri kullanarak. Bu iletişim kuralı adımları bir özetidir ve floresan ve alan parlak photomicrographs temsilcisi ikili ve skeletonized görüntülere dönüştürmek için ve çözümlemek için önerilen ImageJ eklentileri kullanarak yazılım eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D) ve FracLac Morfoloji veri toplamak için. Bu eklentiler çıkış işlemi bitiş noktaları, kavşaklar ve uzunluğu yanı sıra karmaşıklığı, hücre şekil ve boyut tanımlayıcıları açısından hücre morfolojisi özetler. Burada açıklanan iskelet Çözümleme Protokolü bir bütün photomicrograph veya bölge (ROI) ilgi içinde birden çok microglia bir bölgesel analizi için uygun ise FracLac bir tamamlayıcı tek hücre analizi sağlar. Kombine, protokol bir amaç, çeşitli microglia türleri morfoloji sağlıklı ve yaralı beyin mevcut arasında tabakalaşmak için kullanılan hassas ve kapsamlı değerlendirme aracı sağlar.
Microglia beyin fizyolojisi1 olanakları bir süreklilik boyunca hiper yaklaşım ve son derece karmaşık türleri morfoloji arasında değişen de-ramified ve protozlar türleri morfoloji2 için değişiklikler için bir acil ve çeşitli morfolojik tepki var . Microglia3polarize ve çubuk şeklinde de olabilir. Microglia hücre yaklaşım yaygın olarak birden çok işlem sahip karmaşık bir şekil tanımlanır ve genellikle bitiş noktası başına hücre sayısı ve hücre süreçleri uzunluğu bildirilir. Microglia ince ayarlı beri nöronal ve gliyal işlevi ile sürekli hücre-hücre çapraz-hadis ve in vivo hareketliliği4,5, microglia türleri morfoloji farklı hücre işlevler ve işlev bozuklukları göstergeleri olarak hizmet verebilir beyinde. Yeterince tarif bu morfolojik değişiklikler çeşitliliği ve (epilepsi5,6 gibi ince fizyolojik rezonans meydana ramified hücreleri arasındaki farkları ayırt etmek için nicel bir yaklaşım gereklidir ve beyin sarsıntısı7) ek olarak (örneğin, kontur8) Brüt yaralanma. Morfoloji miktar7,8,9,10,11,12,13,14 kullanımının artmasıyla microglia türleri morfoloji tam çeşitliliği sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkaracaktır. ImageJ eklentileri microglia floresan veya floresan photomicrographs üzerinden microglia morfoloji özetlemek gerekli kademeli kullanımı sabit kemirgen dokusunda immünhistokimya (IHC) sonra elde mevcut çalışma ayrıntıları.
Burada açıklanan analiz teknikleri için 2010 yılında büyük meme yapıları, ölçmek için geliştirilmiş ImageJ eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D)15ve ImageJ ve Fraktal analizi için entegre 2014 yılında geliştirilen FracLac16, Merkez bireysel microglia şekiller ölçmek. Bu eklentileri microglia yaklaşım tüm photomicrographs içinde hızlı bir analiz veya birden çok microglia bir photomicrograph içinde tanımlanmış bir yatırım getirisi sağlar. Bu analiz tek başına veya tamamlayıcı fraktal analizi ile kullanılabilir. Tek hücreli fractal analiz (FracLac) zaman bir yatırım gerektirir ama microglia karmaşıklığı, şekli ve boyutu ile ilgili birden çok morfoloji çıkış sağlar. Her iki araç kullanımı gereksiz değil, hücre yaklaşım hücre karmaşıklığı için tamamlayıcı ve birden çok parametre birleşimini farklı microglia türleri veri kümeleri12,17içinde morfoloji arasında ayırt etmek için kullanılabilir.
Microglia hücreleri ince fizyolojisi ve patoloji mikro-etki alanları içinde ayarlanan ve türleri morfoloji2 çeşitli bir yelpazede ince7,14 ve brüt yaralanma8. ImageJ iletişim kurallarının kullanımını microglia morfoloji miktar platformu olarak tüm laboratuvarlar için erişilebilir yapar ve eklentileri bir açık kaynak görüntü işleme yazılımı vardır. Açıklanan protokol görüntü işleme ve analiz bu yazılımı kullanarak üzerinde odaklanmış iken, veri toplama, geçerlilik ve güvenilirlik tutarlılığını mükemmel IHC ve mikroskobu ile başlar. Bu iletişim kuralı ikili, iskelet ve tüm photomicrographs ve tek hücre anahat gösterimleri geliştirmek için kullanılır ama zavallı IHC boyama yer alamaz ve düşük kontrast içinde sonuç mikroskobu bulanık veya görüntü bozuk. Bir ek dikkate, değiştirilemez bir şekilde portaldan microglia morfoloji değiştiren beyin dokusu Muhafazası kesit, öncesinde sırasında değil düzleştirmek için özen göstermelidir. Son olarak, her deneme içinde aynı ölçek gibi aynı mikroskop kullanarak microglia yansıması gerekir. Araçları, amaçları ve yazılım benzer hedefleri rağmen farklı büyüklükteki photomicrographs neden ve detay yanı sıra her çerçeve içinde hücre sayısını değiştirmek mikroskoplar arasında değişir. Örneğin, iki kez sayı hücre ve edinimi Zeiss 880 kullanma daha ayrıntı daha az 40 X objektif bir Leica SPII kullanarak resim alma sonuçlanır. Bu veri örnekleme bir sorun olduğunda bu özellikle tek bir hücre yerine tüm çerçeve toplanan hücre yaklaşım veri için önemlidir.
Genel olarak, hangi tüm photomicrograph iskelet analiz tek hücre fractal analiz iki nedenden dolayı önce gelir. Belirleyici hücre yaklaşım bir photomicrograph tüm hücreleri tek hücre fractal analiz için karşılaştırıldığında ve saat bir faktör ise bir tarama aracı olarak düşünülebilir hızlı. Buna ek olarak, iskelet çözümleme sırasında elde edilen ikili görüntüleri fractal analiz için kullanılır. Yansıma sonra iskelet Çözümleme sonuçlarını etkilemek ve Kullanıcı-etkisi tanıtmak kritik adımlar vardır. Kullanıcılar arasında en değişken Protokolü adımlar adım 4.2 (artan görüntü parlaklığını) ve 4.5 (eşik belirleme) adım. Mümkün olduğu durumlarda, (max veya min kaydırıcısını 0-255 arasında) artırmak için en uygun bir numarası belirler ve tüm görüntüler ve kullanıcılar için sabit tutulan. Görüntü değişkenlik büyük olduğunda, Kullanıcı yerine görüntüler arasında değişir bir parlaklık seçebilirsiniz. Alternatif olarak, görüntüleri parlak ve kontrast yüksek ise, parlaklık artan atlanabilir ve eşik standardize özel eşik filtre kullanarak (Örn., Huang) daha değişken varsayılan yerine. Bir kez en iyi duruma getirilmiş, parametreler için ek Kullanıcı-etkisi en aza indirmek için yapıştırılır.
Bir örnek Kullanıcı değişkenlik Şekil 5‘ te gösterilmiştir. Veri değerleri Kullanıcı 1 Kullanıcı 2 karşı artmış ve eğer Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 veri toplama için katkıda bu nedenle değişkenlik yükseltilmiştir. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve skeletonized görüntüleri farklılıkları örneği olan vurgulanır renkli daireler (Şekil 5). Bu durumda, hem kullanıcılar hem de microglia sınırlı uzmanlık ile kısaca eğitimli lisans öğrencileri vardı. Normal gözetim ve bir microglia ile birlikte artan Protokolü eğitim2 uzman tarafından danışmanlık arası Kullanıcı değişkenliği azaltır. İkili hücreleri el ile ve tek tek izole microglia şekiller belirlemek için yalnızca eşik güvenmek yerine bir photomicrograph olduğundan burada değerlendirildi değil, fractal analiz arası Kullanıcı değişkenlik tabi daha az olsa da. Ancak, tüm yöntemler bazı değişkenlik kullanıcılar arasında bulunur. Bu nedenle, tek bir Kullanıcı (ideal olarak, microglia hücrelerde bazı uzmanlık eğitim) tüm veri kümesinin veri toplama tamamlamak.
Ek değişiklikler bu iletişim kuralı için kolayca yapılabilir ve görüntü kalitesi ve gürültüyü azaltmak ve işlem bağlantısını sağlamak için harcanan çabaları bağlı olacaktır. Örneğin, kontrast yeterli ise, o zaman Keskinliği Azaltma Maskesi gerekli değildir ve atlanabilir. En iyi duruma getirme ve görüntüler, deneysel çalışmaları ve bütün bir set veri toplama önce denetimleri, belirli bir kümesi için protokol sonlandırmak akıllıca olur. Son olarak, ek eklentileri diğerleri yerine açıklamak veya bu protokol için açıklanmayan görüntüleri netleştirmek için kullanılabilir dilate veya keskinleştirme gibi.
Bu iletişim kuralı avantajları onun evrensel kullanılabilirlik ve uyum vardır. Buna ek olarak, AnalyzeSkeleton kullanarak hücre yaklaşım değerlendirirken hızlı ve tüm photomicrograph için geçerli. Çok hücreli analiz yaklaşımı tek hücre yerine bir bütün bölge odaklanmak şeydir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, resmin içinde tüm microglia (bitiş noktaları ve işlem uzunluğu) açısından yaklaşım ortalama değerlendirmek mümkündür. İskelet çözümlemesi sağlayan birden çok hücre Analizi: veri örnekleme tarafından fractal analiz tek photomicrographs hücrelerden yalıtmak için gerekli zaman yatırım nedeniyle eşleştirilemeyen hücre sayıları açısından. Nerede bu en uygun olabilir bir örnek microglia türleri proximities fokal bir sakatlık içinde morfoloji eleme olurdu. IHC photomicrographs iskelet modeller oluşturmak için tüm alan görüntü işleme için daha zaman alıcı tek hücre yaklaşım karşılaştırıldığında kusurlu bir kısıtlamadır. Buna ek olarak, bir bölge analiz nerede microglia türleri morfoloji aynı alanda bulunan büyük ölçüde farklı koşullara uygun değil. Son olarak, bu analiz yöntemi hücre sayısı, deneysel koşullar arasında farklı olabilir bir parametre bağlıdır.
Fractal analiz tek bir hücre üzerinde yapılır ve bu nedenle iskelet çözümlemesinden ortalama hücre yaklaşım veri çıkışı tamamlar. Her ne kadar çok daha zaman alıcı, bu yatırım çok çeşitli xarakteristikaları veri verir. Örneğin, yoğunluk, yayılma oranı, hücre ve döngü veri boyutu, uzama ve hücre anahattının şeklini sırasıyla açıklanmaktadır. Fraktal boyut ve lacunarity hücre karmaşıklığı ve şekil heterojenite, anılan sıraya göre özetler. Her parametre nasıl hesaplanır ve nasıl veri yorumlanır daha ayrıntılı bir özetini içinde etkileşimli el ile16 sağlanır ve bu ayrıntı özel araştırma soru ile ilgili olarak düşünülmelidir. Hassas araçları fizyolojik ve patolojik koşullarda oluşabilir 2D microglia türleri morfoloji küçük değişiklikleri ölçmek için açıklanan protokol sonuçlarında. Sağlamlık, gönderilir ve form faktörü16,20 gibi ek xarakteristikaları analiz 3D şekiller oluşturmak mümkün olabilir.
İletişim kuralı geliştirme ve uyum sürekli ve Kullanıcı tarafından. Bu floresan8 ‘ den DAB/parlak-alan resim7 ama henüz katıştırılmış doku alkol için kapsayacak biçimde genişletilmiştir. Buna ek olarak, bu ek analiz için Imaris gibi özel mülk yazılım ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı Fizyoloji çeşitli için uygulanabilir ve microglia için sınırlı değildir ancak herhangi bir hücre veya doku belirli desen veya IHC yöntemlerle tespit şekilleri ile uygulanabilir. Son olarak, yeterli örnek boyutu ile birden fazla varyasyon veya küme analizi microglia göre morfolojisi12,21tabakalaşmak uygulanabilir; microglia morfoloji microglia işlevleri ve yanıt çevreleri için çok önemli bir göstergesi olarak bu anlamlı bilgi yok. Mikroglial morfolojik çeşitlilik için takdir genişleyen ve tam olarak sağlık ve hastalık sırasında nöron-glia-vasküler etkileşimleri anlamak önemlidir. Bu alanda büyüme ölçmek ve microglia morfoloji birden çok sürekli değişken kullanarak özetlemek için iyi gelişmiş, kullanımı kolay ve tekrarlanabilir protokolleri tarafından geliştirilmiştir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada, NINR (F32NR013611) finansal destek aldı. Ayrıca, kabul ve AnalyzeSkeleton(2D/3D) ve FracLac geliştiriciler teşekkür etmek istiyoruz (Arganda Carreras vd ve Karperien vd., sırasıyla) hangi burada açıklanan analiz mümkün olmazdı olmadan.
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |