Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ
Summary
Microglia são células imunes do cérebro que pesquisa e reagem a fisiologia do cérebro alteradas através de alterações morfológicas que podem ser avaliadas quantitativamente. Este protocolo descreve um ImageJ com base em protocolo de análise para representar microglia morfologia como dados contínuos de acordo com métricas como ramificação de célula, complexidade e forma.
Abstract
Microglia são os fagócitos de cérebro que continuamente seu ambiente por doença, lesão e disfunção de vistoria e participarem na homeostase do cérebro. Como as socorristas, microglia têm funções importantes para atenuar a disfunção do neurônio e glia, e nesse processo, passam por uma ampla gama de alterações morfológicas. Microglia morfologias podem ser categorizadas de forma descritiva ou, alternativamente, podem ser quantificadas como uma variável contínua para parâmetros como ramificação de célula, complexidade e forma. Enquanto métodos para quantificar a microglia são aplicados a células únicas, algumas técnicas se aplicam a microglia múltiplos em uma Fotomicrografia inteira. A finalidade desse método é quantificar múltiplo e única células usando protocolos ImageJ prontamente disponíveis. Este protocolo é um resumo das etapas e plugins ImageJ recomendado para converter fotomicrografias de fluorescência e brilhante-campo em imagens binárias e esqueletizadas representante e analisá-los usando o software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) e FracLac morfologia recolha de dados. As saídas desses plugins resumem morfologia celular em termos de pontos de extremidade do processo, junções e comprimento, bem como complexidade, forma da célula e descritores de tamanho. O protocolo de análise esqueleto aqui descrito é bem adequado para uma análise regional de micróglia múltiplos dentro de uma Fotomicrografia toda ou a região de interesse (ROI), Considerando que FracLac fornece uma análise complementar célula individual. Combinado, o protocolo fornece um objetivo, uma ferramenta de avaliação sensível e abrangente que pode ser usada para estratificar entre microglia diversas morfologias presentes no cérebro saudável e ferido.
Introduction
Microglia têm uma resposta morfológica imediata e diversa alterações no cérebro fisiologia1 ao longo de um continuum de possibilidades que variam de hiper-ramificação e altamente complexas morfologias a eliminação ramificadas e ameboides morfologias2 . Microglia também pode tornar-se polarizada e de forma cilíndrica3. Ramificação de célula microglia é comumente definida como uma forma complexa, tendo vários processos e muitas vezes é relatada como o número de pontos de extremidade por célula e a duração dos processos celulares. Desde microglia são finamente ajustados a função neuronal e glial através do celular contínua cross-talk e na vivo motilidade4,5, microglia morfologias podem servir como indicadores de célula diversas funções e disfunções no cérebro. Uma abordagem quantitativa é necessária para descrever adequadamente a diversidade dessas alterações morfológicas e de distinguir as diferenças entre células ramificadas que ocorrem com sutis perturbações fisiológicas (como epilepsia5,6 e concussão7) Além de prejuízo bruto (tais como acidente vascular cerebral8). Um aumento da utilização de morfologia quantificação7,8,9,10,11,12,13,14 revelará a completa diversidade de morfologias microglia durante saúde e doença. O presente estudo detalhes o uso gradual do ImageJ plugins necessários para resumir microglia morfologia de fotomicrografias fluorescentes ou não-fluorescente de micróglia adquirido em tecido de roedor fixo depois de imuno-histoquímica (IHC).
Central para as técnicas de análise descritas aqui são o ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, desenvolvido em 2010 para quantificar a grandes estruturas mamárias e FracLac16, desenvolvido em 2014 para integrar a análise ImageJ e fractal para quantificar as formas individuais microglia. Esses plugins fornecem uma análise rápida da microglia ramificação dentro fotomicrografias inteiras ou microglia múltiplas de um ROI definido dentro uma Fotomicrografia. Esta análise pode ser usada sozinho ou em complemento com análise fractal. A análise fractal de célula única (FracLac) requer um investimento de tempo, mas fornece várias saídas de morfologia em relação a tamanho, forma e complexidade microglia. O uso de ambas as ferramentas não é redundante, como célula ramificação é complementar à complexidade da célula, e a combinação de vários parâmetros pode ser utilizada para distinguir microglia diversas morfologias dentro de conjuntos de dados12,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células da micróglia são finamente sintonizadas com a fisiologia e patologia dentro de seus domínios-micro e exibir uma gama diversificada de morfologias2 em sutil7,14 e prejuízo bruto8. O uso de protocolos ImageJ faz a quantificação de morfologia microglia acessível a todos os laboratórios como a plataforma e plugins são uma imagem de open source software de processamento. Enquanto o protocolo descrito é focado em processamento de imagem e análise usando este software, a consistência da coleta de dados, validade e confiabilidade começa com excelente IHC e microscopia. Este protocolo é usado para melhorar o binário, esqueleto e representações de contorno de toda fotomicrografias e células únicas, mas não pode tomar o lugar do pobre IHC coloração e microscopia que resulta em baixo contraste, borradas ou distorcidas imagens. Como uma consideração adicional, tenha cuidado para não achatar o tecido cerebral durante o armazenamento, antes do corte, o que altera irrevogavelmente microglia morfologia. Por último, dentro de cada experimento, microglia deve ser fotografada usando a mesma escala, bem como o mesmo microscópio. Instrumentação, objectivos e software variam entre microscópios que resultará em diferentes tamanhos fotomicrografias apesar de objectivos semelhantes e mudar os detalhes, bem como o número de células dentro de cada quadro. Por exemplo, aquisição de imagem usando um objectivo X 40 em uma Leica SPII resulta em duas vezes o número de células e menos detalhes do que usando um Zeiss 880 de aquisição. Isto é particularmente importante célula ramificação da recolha de dados de todo o quadro, ao invés de uma única célula, como isto se torna uma questão de amostragem de dados.
Em geral, análise de esqueleto que utiliza a Fotomicrografia toda precede a análise fractal única célula por dois motivos. Ramificação de célula determinante de todas as células em uma Fotomicrografia é rápida quando comparada à análise fractal de célula única e pode ser considerado como uma ferramenta de rastreio, se o tempo é um fator. Além disso, as imagens binárias derivadas durante a análise do esqueleto são utilizadas para análise fractal. Uma vez que a criação da imagem, há uma série de passos críticos que podem influenciar os resultados da análise de esqueleto e introduzir o usuário-influência. As etapas de protocolo que são a maioria das variáveis entre usuários estão etapa 4.2 (brilho crescente da imagem) em 4.5 (determinação do limiar). Sempre que possível, um número ideal para aumentar a luminosidade (max ou min controle deslizante entre 0-255) é determinado e mantido constante para todos os usuários e imagens. Onde a variabilidade de imagem é grande, o usuário pode escolher em vez de um brilho que pode variar entre imagens. Como alternativa, se as imagens são brilhantes e contraste é alta, então aumentar o brilho pode ser omitido e limiarização pode ser padronizada, usando um filtro de limiar de especialidade (ex., Huang) em vez do padrão mais variável. Uma vez otimizado, os parâmetros devem ser observados a fim de minimizar a influência-usuário adicional.
Um exemplo de variabilidade de usuário é apresentado na Figura 5. Valores de dados foram aumentados em usuário 1 contra 2 do usuário e, portanto, variabilidade seria aumentada se tanto usuário 1 e 2 do usuário contribuíram para a coleta de dados. Um exemplo das diferenças no usuário 1 e 2 do usuário binárias e esqueletizadas imagens são destacados por círculos coloridos (Figura 5). Neste caso, ambos os usuários foram brevemente treinados estudantes com experiência limitada no microglia. Supervisão regular e orientação por um microglia perito juntamente com protocolo maior formação2 podem reduzir a variabilidade inter-user. Embora não avaliados aqui, análise fractal é menos sujeito a variabilidade inter usuário porque células binárias são manualmente e individualmente isoladas uma Fotomicrografia ao invés de depender exclusivamente de limiarização para determinar formas de micróglia. No entanto, todos os métodos possuem uma variabilidade entre os usuários. Portanto, um único usuário (idealmente, treinado por alguma experiência nas células da microglia) deve concluir a coleta de dados para um dataset inteiro.
Modificações adicionais podem ser facilmente feitas ao presente protocolo e dependerão a qualidade da imagem e os esforços desenvolvidos para reduzir o ruído e garantir a ligação de processo. Por exemplo, se o contraste for adequada, máscara de nitidez não é necessária e pode ser omitida. É prudente otimizar e finalizar o protocolo para um conjunto específico de imagens, ambos os casos experimentais e controles, antes da coleta de dados de um conjunto inteiro. Por fim, plugins adicionais pode ser usado no lugar de outros para clarificar ou aguçar imagens que não foram descritas no presente protocolo como dilatar ou aguçar.
Vantagens do presente protocolo são sua disponibilidade universal e adaptabilidade. Além disso, avaliar a ramificação de célula usando AnalyzeSkeleton é rápida e aplicável a uma Fotomicrografia inteira. Uma vantagem da abordagem de análise de várias células é o foco de toda uma região, ao invés de células únicas. Portanto, é possível avaliar rapidamente a ramificação média (em termos de pontos de extremidade e comprimento de processo) de micróglia todos dentro da imagem. Análise de esqueleto fornece uma análise de várias células: uma amostragem de dados em termos de números de celular que não podem ser igualadas por análise fractal devido o investimento de tempo necessário para isolar células únicas de fotomicrografias. Uma instância que possa ser mais adequado seria no rastreio microglia morfologias nas proximidades de uma lesão focal. Uma limitação é o processamento de imagem de todo campo para criar modelos de esqueleto de fotomicrografias IHC é imperfeito quando comparado com a abordagem única célula mais demorada. Além disso, uma análise da região não é adequada às circunstâncias onde morfologias microglia são drasticamente diferentes dentro do mesmo campo. Por último, este método de análise é dependente da contagem de células, um parâmetro que pode ser diferente entre as condições experimentais.
Análise fractal é realizado em uma única célula e, portanto, complementa a saída de dados de ramificação de célula média resultante da análise de esqueleto. Embora muito mais demorada, este investimento produz uma ampla gama de dados morfométricos. Por exemplo, célula de densidade, relação de extensão, e dados de circularidade descrevem o tamanho, alongamento e forma de contorno da célula, respectivamente. Lacunarity e dimensão fractal resumem a célula complexidade e heterogeneidade de forma, respectivamente. É fornecido um resumo mais profundo de como cada parâmetro é calculado e como os dados podem ser interpretados no manual interativo16 e tal detalhe deve ser considerado em relação à questão específica de pesquisa. O protocolo descrito resulta em sensíveis ferramentas para quantificar pequenas mudanças em 2D microglia morfologias que podem ocorrer em condições fisiológicas e patológicas. Análise morfométrica adicionais como solidez, convexidade e fator de formulário16,20 pode ser possível se gerando formas 3D.
Adaptação e desenvolvimento de protocolo é contínuo e controlado pelo usuário. Isso foi estendido de fluorescência8 DAB/brilhante-campo imagens7 , mas ainda não tecido incorporado de parafina. -Além disso, pode ser usada em conjunto com software proprietário como hottie para análise adicional. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de Fisiologia e não está limitado a microglia, mas pode ser aplicado a qualquer célula ou tecido com padrões particulares ou formas que podem ser identificadas usando métodos IHC. Por último, com tamanho de amostra suficiente, uma análise multivariada ou cluster pode ser aplicada para estratificar microglia de acordo com a morfologia de12,21; Isto é informações significativas como morfologia microglia é um indicador vital da microglia funções e respostas a seus arredors. O apreço pela diversidade morfológica microglial é importante para compreender inteiramente interações neurônio-glia-vascular durante a saúde e a doença e em expansão. Crescimento neste campo é reforçado por protocolos bem desenvolvidos, fácil de usar e pode ser reproduzidos para quantificar e resumir microglia morfologia usando múltiplas variáveis contínuas.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo recebeu apoio financeiro da NINR (F32NR013611). Nós gostaríamos de reconhecer e agradecer os desenvolvedores de AnalyzeSkeleton(2D/3D) e FracLac (Arganda-Carreras et al e Karperien et al, respectivamente) sem que a análise aqui descrita não seria possível.
Materials
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
Riferimenti
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer’s disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscienze. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014)
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).
