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Neuroscienze

Quantificare la morfologia di Microglia da microfotografie di Immunohistochemistry preparato tessuto usando ImageJ

Published: June 05, 2018
doi:
10.3791/57648
,
1College of Nursing,University of Arizona

Summary

Le microglia sono cellule immunitarie del cervello che rilevare e reagiscono alla fisiologia cerebrale alterata attraverso cambiamenti morfologici che può essere valutata quantitativamente. Questo protocollo illustra un ImageJ basato su protocollo di analisi per rappresentare le microglia morfologia come dati in continuo secondo metriche come ramificazione delle cellule, la complessità e la forma.

Abstract

Le microglia sono fagociti di cervello che partecipano nell’omeostasi del cervello e indagine continuamente il loro ambiente per disfunzione, ferite e malattie. Come i primi soccorritori, microglia hanno importanti funzioni per attenuare la disfunzione del neurone e glia, e in questo processo, subiscono una vasta gamma di cambiamenti morfologici. Microglia morfologie possono essere classificate in modo descrittivo o, in alternativa, possono essere quantificate come variabile continua per parametri quali la ramificazione delle cellule, la complessità e la forma. Mentre metodi per quantificare la microglia sono applicati a singole cellule, alcune tecniche applicano a più microglia in un intero microfotografia. Lo scopo di questo metodo è quello di quantificare multiple e singole celle utilizzando protocolli ImageJ prontamente disponibili. Questo protocollo è un riepilogo dei passaggi e plugin di ImageJ consigliato per convertire microfotografie di fluorescenza e campo chiaro in immagini rappresentative di binarie e scheletrate e ad analizzarli utilizzando software plugin AnalyzeSkeleton (2D/3D) e FracLac per la raccolta di dati di morfologia. Le uscite di questi plugin riassumono la morfologia delle cellule in termini di processo endpoint, giunzioni e lunghezza così come complessità, forma delle cellule e descrittori di dimensione. Il protocollo di analisi scheletro descritto nel presente documento è adatto per un’analisi regionale di microglia multipli all’interno di una microfotografia intero o un’area di interesse (ROI) mentre FracLac fornisce un’analisi complementare delle singole celle. Combinato, il protocollo prevede un obiettivo, strumento di valutazione sensibile e completa che può essere usato per stratificare tra microglia diverse morfologie presenti nel cervello sano e ferito.

Introduction

Microglia hanno una risposta immediata e diversificata morfologica alle alterazioni nel cervello fisiologia1 lungo un continuum di possibilità che vanno da iper-ramificazione ed estremamente complesse morfologie a-ramificate e ameboidi morfologie2 . Microglia può anche diventare polarizzate e asta-a forma di3. Ramificazione delle cellule di microglia è comunemente definito come una forma complessa, avendo più processi e viene spesso segnalato come il numero di endpoint per la cellula e la lunghezza dei processi delle cellule. Poiché le microglia sono finemente sintonizzato alla funzione di un neurone e glial attraverso cellulare continuo cross-talk e in vivo della motilità4,5, microglia morfologie possono servire da indicatori di cellule diverse funzioni e disfunzioni nel cervello. Un approccio quantitativo è necessario per descrivere adeguatamente la diversità di questi cambiamenti morfologici e per distinguere le differenze tra cellule ramificate che si verificano con sottili perturbazioni fisiologiche (ad esempio l’epilessia5,6 e commozione cerebrale7) oltre che ferita lordo (ad esempio colpo8). Un maggiore uso di morfologia quantificazione7,8,9,10,11,12,13,14 ti rivelano la diversità completa delle morfologie di microglia durante salute e nella malattia. Il presente studio dettagli l’uso graduale di ImageJ plugin necessario riepilogare microglia morfologia da fluorescente o non fluorescente microfotografie di microglia acquisita nel tessuto fisso roditore dopo esame immuno-istochimico (IHC).

Centrale per le tecniche di analisi descritte qui sono il ImageJ plugin AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, sviluppato nel 2010 per quantificare grandi strutture mammarie e FracLac16, sviluppato nel 2014 per integrare l’analisi ImageJ e frattale di quantificare la microglia singole forme. Questi plugin forniscono una rapida analisi della microglia ramificazione all’interno di intero microfotografie o più microglia di un ROI definito all’interno di una microfotografia. Questa analisi può essere utilizzata da solo o in complemento con analisi frattale. L’analisi frattale di singola cellula (FracLac) richiede un investimento di tempo, ma fornisce uscite multiple di morfologia per quanto riguarda la complessità di microglia, forma e dimensione. L’uso di entrambi gli strumenti non è ridondante, come cellula di ramificazione è complementare alla complessità delle cellule e la combinazione di diversi parametri può essere utilizzata per distinguere tra microglia diverse morfologie all’interno di DataSet12,17.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati da ed effettuati in conformità alle linee guida stabilite dal comitato di utilizzo e la cura degli animali istituzionali di Università dell’Arizona e le linee guida NIH per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. Cura è stata presa per ridurre al minimo il disagio e il dolore degli animali. Metodi di eutanasia sono secondo un protocollo approvato e consistono di decapitazione cervicale nell’ambito dell’anestesia isoflurano. 1. tessuto preparazione Nota: Eseguire microglia morfologia analisi su campioni di tessuto prelevate fissi, per preservare la morfologia delle cellule. Di seguito è riportato un protocollo standard per preparare ed affettare direttamente tessuto fisso per fluorescenza IHC. Rimuovere i cervelli di topo o ratto da un animale eutanasizzato dopo l’esperimento desiderato e secondo un protocollo standard di laboratorio. Mettere il cervello in un flaconcino da 10 mL contenente 5 mL di una soluzione di paraformaldeide 4% per 24 h a 4 ° C. Quindi risciacquare e posto in 5-10 mL di un 30% saccarosio fosfato soluzione tampone (PBS, 0.01 M) per 72 h a 4 ° C. Se sezionamento con un microtomo, conservare intero cervello a-80 ° C fino al tessuto di sezionamento con un criostato, o a 4 ° C.Nota: Questo protocollo non è ancora stato testato usando il tessuto affettato dal tessuto paraffina-incastonato. Sezione del tessuto cerebrale allo spessore di sezione desiderata e orientamento utilizzando sezioni digalleggiante sia un criostato o microtomo e conservare in una soluzione di crioprotezione (50mm PBS, glicole etilenico, glicerolo) a-20 ° C.Nota: Questo protocollo è stato effettuato con successo su sezioni di tessuto coronale che vanno da 50 µm a 200 µm di spessore. Tessuto sezioni meno di 50 µm non può acquisire la piena portata dei processi di microglia, mentre nelle sezioni di tessuto spesso, IHC che macchia può essere imperfetta a causa della penetrazione dell’anticorpo nel tessuto. Tessuto può essere sia sezionato in una coronale o sagittale orientamento e questa scelta dipenderà molto sperimentale regioni obiettivo e cervello per essere studiato. 2. esame immuno-istochimico Nota: I metodi di analisi frattale e scheletro possono essere applicati a fluorescenza o 3, 3 ‘-diaminobenzidina (DAB) IHC. Di seguito è un protocollo IHC fluorescenza standard e può essere sostituito se necessario. Fluorescenza IHC produce ottime condizioni di visibilità dei processi delle cellule rispetto a DAB IHC. Inserire le sezioni di tessuto in un flaconcino di vetro da 4 mL (fino a 15 cervello del mouse sezioni/flaconcino) e incubare con 1 mL di soluzione contenente fino al 10% di siero equino, PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3 a temperatura ambiente (23 ° C) per 1 h. Lavare per 5 minuti con PBS (0.01 M) tre volte a temperatura ambiente. Incubare con l’anticorpo primario (Iba1, 1:1, 000) a temperatura ambiente per 72 h in 1 mL di soluzione contenente PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3e coperto (per preservare l’efficacia di3 NaN). Lavare per 5 minuti con PBS (0.01 M) tre volte a temperatura ambiente. Incubare con l’anticorpo secondario (anti-coniglio 488, 1: 250) coperto a temperatura ambiente per 4 h in 1 mL di soluzione contenente PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3 Lavare per 5 minuti con PBS (0.01 M) tre volte a temperatura ambiente. Montare le sezioni di tessuto cerebrale (numero e orientamento basato sulla preferenza) a subbed diapositive, applicare un mezzo di montaggio soft-insieme alla diapositiva e posizionare il vetrino coprioggetto sopra il tessuto. Archiviare le diapositive a 4 ° C.Nota: Uno spessore del vetrino coprioggetti di 1,5 vetro è necessario per l’imaging confocale. Soft-set è un mezzo di montaggio comodo perché l’elevata viscosità non comprime il tessuto e meglio conserva la morfologia rispetto ai mezzi di montaggio torvo. 3. imaging Immagine Iba1 cellule positive nella sezione di tessuto cerebrale usando un microscopio a campo chiaro o confocale che ha una capacità di acquisizione di z-stack utilizzando un 20x obiettivo o maggiore.Nota: I parametri e del software di Imaging deve essere costante per tutti i Fotomicrografo acquisizione in un esperimento. Dettaglio processo eccellente viene ottenuto utilizzando un 40x o 63 X obiettivo. È possibile applicare il protocollo di analisi scheletro descritto nel presente documento per una microfotografia intero o un ROI della multi-cellula all’interno di un più grande microfotografia. Acquisire immagini a 8 bit utilizzando le impostazioni di software appropriato specifiche per il software di microscopio.Nota: La conversione di file a 8 bit post-acquisizione può falsare la raccolta dei dati. Acquisire almeno un 30 µm z-stack con non più di un intervallo di 2 µm tra immagini, utilizzando le impostazioni di software appropriato specifiche per il software di microscopio.Nota: Il microscopio e il software dovrebbe consentire per acquisizione di immagini in un asse X, Y e Z. Uno z-stack può essere aumentato, e l’intervallo può essere diminuita per fornire dettagli aggiuntivi microglia. In cambio, imaging tempo aumenterà. Utilizzo del campionamento di Nyquist ove possibile per microscopia di fluorescenza. Salvare tutti i file come file Tif o come richiesto dal software di microscopio. Aprire i file Tif in ImageJ e utilizzare la barra degli strumenti per dividere canali cliccando immagine | Colore | Canali di divisionee stack di immagini cliccando immagine | Stack | X progetto | Massima intensità di proiezione se del caso. Salvare come file. TIF. 4. scheletro analisi Scarica FIJI o ImageJ da . Per i singoli plugin, scaricare AnalyzeSkeleton(2D/3D) da 15 e scaricare FracLac da 16.Nota: L’intero processo di conversione di una microfotografia a un’immagine binaria scheletrata richiede meno di 1 min. Se si utilizza una microfotografia di fluorescenza, garantire che l’immagine è a 8 bit e convertire in scala di grigi per meglio visualizzare tutti macchiatura positiva. Utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su immagine | Tabelle di ricerca | Grigi. Se si utilizza una fotografia del luminoso-campo DAB, primo utilizzo il passa-banda FFT filtra plugin (usando la barra degli strumenti cliccando processo | FFT | filtro passa-banda) e poi convertire in scala di grigi.Nota: Ai fini del presente protocollo, le impostazioni predefinite di ImageJ per un filtro FFT sono sufficiente (filtro fino a 3 pixel, fino a 40, nessuna soppressione di striscia). Applicazione di un filtro passa-banda FFT rimuove il rumore (piccole caratteristiche) pur conservando gli aspetti nel complesso più grandi dell’immagine. Ciò è particolarmente utile in immagini luminose del campo, dove si divide e crepe nel tessuto possono apparire come sfondo e quindi complicare l’ analisi scheletro18. Se l’immagine è troppo debole e non può essere visualizzato il processo di microglia, regolare la luminosità e il contrasto. Utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su immagine | Regolare | Luminosità/contrasto. Regolate i cursori di minimi o massimi come necessario, fino ai bordi dell’istogramma ma non oltre.Nota: In ImageJ, luminosità e contrasto vengono modificati mediante l’aggiornamento tabella di ricerca dell’immagine (LUT), quindi i valori dei pixel sono rimasti invariati. Max e min cursori controllano i limiti inferiori e superiori dell’intervallo di visualizzazione, con i valori dei pixel superiori a 255 che appare bianco e i valori dei pixel sotto 0 comparendo nero18. Nel caso di microfotografie di fluorescenza, deve essere utilizzato il dispositivo di scorrimento massimo, considerando che il dispositivo di scorrimento minimo verrà utilizzato per microfotografie di DAB macchiato microglia. Eseguire un filtro maschera di contrasto per aumentare ulteriormente il contrasto utilizzando la barra degli strumenti facendo clic processo | Filtri | Maschera di contrasto. Ai fini del presente protocollo, impostazioni predefinite di ImageJ (un raggio dei pixel di 3 e mascherare peso 0,6) vengono utilizzati.Nota: Maschera di contrasto aumenta la nitidezza e migliora le funzioni di bordo di un’immagine sottraendo una versione offuscata dell’immagine (maschera di contrasto) rispetto all’originale, e quindi unendo l’immagine risultante con una versione ad alto contrasto dell’immagine originale. Di conseguenza, il filtro maschera di contrasto non crea particolari, ma piuttosto chiarisce i dettagli in un’immagine esistenti. Il raggio di modifiche alle impostazioni come sfocata la Unsharp Mask sarà (e così quanto sfocatura verrà rimosso), e il peso di maschera impostazione cambia il grado di contrasto che la Unsharp Mask verranno unite con (e quindi regola il contrasto dell’immagine finale). Eseguire un passaggio di smacchiatura per rimuovere il rumore sale e pepe, generato dalla maschera di contrasto. Utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su processo | Rumore | Smacchia.Nota: Smacchia rimuove il rumore sale e pepe, sostituendo ogni pixel con il valore mediano nel suo quartiere di 3 × 3. L’effetto è che outlier in intensità vengono sostituiti dal mediano pixel senza compromettere la nitidezza dei bordi18. Convertire l’immagine in binario utilizzando la barra degli strumenti facendo clic immagine | Regolare | Soglia.Nota: La soglia stratifica le immagini in scala di grigi in caratteristiche di interesse contro sfondo e converte l’immagine in binario18. Applicare la smacchiatura, stretta-e rimuovere le funzioni dei valori erratici: nell’immagine binario risultante, ci può essere rumore di fondo di singolo pixel e le lacune tra i processi. Applicare la funzione di smacchiatura utilizzando la barra degli strumenti facendo clic processo | Rumore | Smacchia.Nota: L’applicazione Smacchia il binario di immagine rimuove qualsiasi rumore singolo pixel rimanenti. Applicare la funzione di chiusura utilizzando la barra degli strumenti facendo clic processo | Binario | Vicino.Nota: Questo plugin si connette due pixel scuri se sono separati da fino a 2 pixel. Applicare la funzione di valori erratici di rimuovere utilizzando la barra degli strumenti facendo clic processo | Rumore | Rimuovere i valori erratici.Nota: Ai fini del presente protocollo, brillante valori erratici sono destinati con un raggio dei pixel di 2 e un limite di 50. Questo plugin sostituisce un pixel luminoso o scuro outlier dai pixel mediano nella zona circostante se si discosta di più di un certo valore (la soglia)18. Salvare l’immagine come un file separato per future analisi utilizzo e/o frattale e divorare l’immagine utilizzando la barra degli strumenti facendo clic processo | Binario | Inscheletrire. Selezionare l’immagine scheletrato ed eseguire il plugin AnalyzeSkeleton(2D/3D) utilizzando la barra degli strumenti facendo clic plugin | Scheletro | Analizzare lo scheletroe selezionando la casella di informazioni Branch.Nota: È probabile che l’elaborazione di immagini richiederà ottimizzazione con l’aggiunta o l’eliminazione dei passaggi suggeriti sopra. In questo processo, scheletrati immagini sono valutate per precisione creando una sovrapposizione dello scheletro e l’immagine originale. Somas dovrebbero essere punti di origine singola con processi che emana dal centro; circolare somas confondere i dati e dovrebbe essere evitato attraverso la regolazione di protocollo. Nella Figura 1è illustrato un esempio di un punto di origine singola contro i somas circolari. Problemi comuni con conseguente scheletri non rappresentativi e suggerito soluzioni: Immagine troppo scura: convertire in scala di grigi, regolate i cursori Luminosità/contrasto, e/o applicare la maschera di contrasto Troppo sfondo: regolate i cursori Luminosità/contrasto, applicare smacchiatura, e/o rimuovere i valori erratici Somas circolare nell’immagine scheletrato (specialmente per le immagini di fluorescenza): applicare il filtro passa-banda FFT, e/o maschera di contrasto Crepe nel tessuto (specialmente per le immagini di campo chiaro): applicare il filtro passa-banda FFT, e/o Smacchia Copiare tutti i dati dai risultati e informazioni Branch uscite e incollare i dati in un foglio di calcolo Excel. In Excel, è necessario tagliare i dati per rimuovere frammenti di scheletro derivanti dall’acquisizione di IHC e immagine. Duplicare la cartella di lavoro di esperimento con l’output di dati non elaborati dall’analisi dello scheletro e aggiungere TRIM al nome del file. Rimozione di dati successivi tutti dovrebbe verificarsi nella cartella duplicata per preservare i dati grezzi per un utilizzo futuro e riferimento. Determinare quale lunghezza dei frammenti verrà ritagliata dal dataset aprendo l’immagine scheletrato in ImageJ e selezionando lo strumento linea. Misurare parecchi frammenti, prendendo nota della lunghezza media e decidere su un valore di cutoff.Nota: Ai fini dei dati presentati qui, la lunghezza di taglio per frammenti indesiderati è 0,5. Questo valore deve essere coerenza in tutto un set di dati. Personalizzato ordinare il foglio di calcolo Excel da facendo clic su Ordina e filtra | Ordinamento personalizzato. Ordina per “endpoint voxels” dal più grande al più piccolo e, in un nuovo livello, da “Mx ramo pt” dal più grande al più piccolo. Rimuovere ogni riga che contiene 2 endpoint con una lunghezza massima ramo inferiore rispetto al valore di cut-off (cioè., 0,5). Somma i dati nella colonna endpoint per calcolare il numero totale di endpoint raccolti dall’immagine. Ripetizione di dati le informazioni ramo: Ordina ‘lunghezza del ramo’ dal più grande al più piccolo. Scorrere i dati e rimuovere ogni riga che ha una lunghezza di ramo di meno che il valore di cut-off(cioè., 0,5). Sommare i valori nella colonna lunghezza ramo per calcolare la lunghezza totale di tutti i rami raccolti dall’immagine. Ripetere i passaggi 4.11.3-4.11.5 per ogni immagine/foglio fino a quando tutti i dati sono stati tagliati e sommati. Dividere i dati da ogni immagine (sommare il numero di endpoint e sommati lunghezza del ramo) per il numero di microglia somas nell’immagine corrispondente. Inserire i dati finali (endpoint/cella & ramo lunghezza/cella) software statistico.Nota: I dati di lunghezza/cella sommati ramo possono richiedere la conversione dalla lunghezza in pixel a micron. 5. analisi frattale Nota: FracLac è in grado di eseguire una serie di analisi di forma diversa che non rientrano in questo protocollo. Per una spiegazione più dettagliata di FracLac di varie funzioni, consultare il manuale di FracLac e riferimenti associati 2,16,19. Analisi frattale utilizza passaggi del protocollo 4.1-4.7 descritto sopra. Determinare la dimensione del ROI che verrà utilizzato per tutte le analisi frattale. Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare il ROI. Assicurarsi che la scatola è grande abbastanza per catturare l’intera cella e può rimanere coerenza in tutto il set di dati.Nota: Utilizzare la selezione rettangolo anziché la selezione a mano libera per garantire che tutte le ROIs sono lo stesso rettangolo di dimensione, e di conseguenza, le cellule hanno la stessa scala. Questo non sarebbe il caso se la selezione a mano libera sono stata utilizzata perché ImageJ sarà auto-scala un ROI quadrato per adattarsi a diverse dimensioni finestre rettangolari conseguente cellule con diverse scale. Mentre forme frattali sono indipendenti dalla scala, il processo di analisi frattale utilizzando FracLac per ImageJ dipende dalla scala16. Così, c’è la necessità di un ROI costantemente dimensione tutta la collezione di dati. Selezionare casualmente microglia per analisi frattale in ogni microfotografia e la corrispondente immagine binaria. Nella finestra di gestione di ROI, selezionare aggiornamento per agganciare il ROI della posizione della cella. Utilizzare Ctrl + Maiusc + D per duplicare l’area all’interno il ROI come una nuova finestra e quindi salvare la cella ritagliata. Sull’immagine binario corrispondente (dall’analisi dello scheletro), è necessario duplicare l’area con la stessa cella utilizzando il gestore di ROI. Ripetere fino a quando un numero sufficiente di cellule è stato selezionato in modo casuale per analisi frattale e Salva tutti i file.Nota: Un generatore di numeri casuali e una griglia numerata utilizzabile per selezionare in modo casuale le celle. Aprire l’immagine binaria con la singola cella. Fare doppio clic sullo strumento pennello, impostare il colore su nero e regolare la larghezza del pennello, se necessario. Utilizzando il corrispondente microfotografia come riferimento, utilizzare il pennello per rimuovere i processi delle cellule adiacenti, connettere processi frammentati e isolare la cellula di interesse. Una volta che la cella binaria è stata isolata, salvare il file binario.Nota: Tenendo premuto ‘alt’ passa il pennello dal colore di primo piano (nero) per il colore di sfondo (bianco). Convertire la cella binaria in una struttura utilizzando la barra degli strumenti tramite processo | Binario | Muta.Nota: FracLac per immagine J può essere utilizzato su entrambi forme solide o forma delinea, tuttavia, attuale Convenzione è di usare la forma delinea16. Nella barra degli strumenti, aprire FracLac utilizzando la barra degli strumenti facendo clic plugin | Analisi frattale | FracLac e selezionare BC (casella contando). Nelle impostazioni del Disegno di griglia , impostare Num G 4. In opzioni di grafica , selezionare la casella di metriche per analizzare il guscio convesso e il cerchio di delimitazione della cella. Al termine, selezionare OK.Nota: Num G è il numero di orientamenti di griglia utilizzati durante la scansione vengono considerati e l’intervallo consigliato per Num G 4-12. L’impostazione di Num G e l’intervallo consigliato è accuratamente esaminata nel manuale FracLac16. Aumentando Num G può rallentare in modo significativo tempi di calcolo. FracLac impostazioni basterà impostare una volta per sessione. Dopo avere inserite le impostazioni, è possibile che il pulsante di scansione diventerà disponibile. Selezionare il pulsante Scan per eseguire una scansione di casella-contando sull’immagine selezionata.Nota: La scansione genererà tre finestre con uscite dati: scafo e cerchio risultati, conte di casella riepilogo File e tipi di scansione. La finestra di scansione tipi contiene un registro delle impostazioni utilizzate, deviazioni anche come standard per alcune misure. Ai fini del presente protocollo, la finestra tipi di scansione non viene utilizzata e può essere chiuso o salvata per riferimenti futuri. Nella finestra dello scafo e Cerchio risultati , copiare dati tutti desiderati (cioè., densità, rapporto di span e circolarità) risultati. Nella finestra di Riepilogo casella di conteggio , copiare i dati desiderati (cioè., dimensione frattale e lacunarity) risultati. Trasferire i dati copiati in un file di Excel o software statistico.Nota: Un elenco completo del FracLac output dati sono forniti e accuratamente spiegati in FracLac per ImageJ manuale16.

Representative Results

I protocolli di analisi di morfologia microglia descritti qui riassumono passaggi utili nell’elaborazione fluorescenti e DAB microfotografie per analisi morfometrica. Questi passaggi sono visivamente riassunti nella Figura 2 e Figura 3. L’obiettivo della procedura è quello di creare un’immagine rappresentativa di binaria e scheletrata che modella in modo appropriato la microfotografia originale tale che i dati accumulati sono validi. Dopo l’applicazione del protocollo, il plugin di AnalyzeSkeleton si traduce in un’immagine dello scheletro contrassegnata da cui il numero di endpoint e ramo (i. e., processo) lengthpuò essere riassunte dai file di output risultante. Gli endpoint e i dati di lunghezza di processo vengono quindi utilizzati per stimare il grado di ramificazione di microglia nella microfotografia o ROI. Figura 4 riepiloga i dati risultanti (endpoint/cella e processo di lunghezza/cella) raccolti con e senza l’applicazione del protocollo. Mentre le tendenze simili esistono, i dati riassunti nella Figura 4F sono meno variabile rispetto a quelli in Figura 4E. Inoltre, questi dati illustrano una maggiore sensibilità per rilevare le differenze tra i gruppi quando viene applicato il protocollo. Infine, si deve prestare attenzione relativa variabilità inter-utente nell’applicazione del protocollo. Tali differenze sono riassunti dalla Figura 5 , dove lo stesso set di dati è stato analizzato da due utenti indipendenti applicando un protocollo identico come riepilogato sopra. Morfologia di ulteriori dati vengono raccolti da singole cellule isolate dalle immagini binarie create durante l’applicazione del protocollo. La procedura di protocollo per analizzare la morfologia di microglia prima e utilizzando il plugin di FracLac sono riassunti nella Figura 6. Abbiamo illustrare questa analisi in entrambi illeso (Figura 6A) e ferite del tessuto (Figura 6B). Immagini rappresentative di binario, profilato, convesso scafo/incapsulamento cerchio ed esempi conteggio casella per ogni cella analizzati con e senza il protocollo di applicazione sono mostrati in Figura 6–F. Queste immagini consentono di illustrare le origini delle differenze nei dati di morfologia che sono riassunti nella Figura 6. Figura 1. Illustrazioni di microglia scheletrata con un soma circolare (non ottimale) contro un soma di singola origine (Ottimo) e la corrispondente sovrapposizione tra la cella scheletrata e l’originale microfotografia. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Protocollo di applicazione a fluorescente microfotografie. Illustrazioni del protocollo scheletro analisi applicata a una microfotografia fluorescente con una singola cella ritagliata per visualizzare i dettagli. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Applicazione del protocollo a campo chiaro DAB microfotografie. Illustrazioni del protocollo scheletro analisi applicata a una microfotografia DAB campo chiaro con una singola cella ritagliata per visualizzare i dettagli. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4. Analisi dei dati con e senza l’applicazione del protocollo. (A) una microfotografia di esempio di IHC fluorescente e ritagliata cella corrispondente alla casella gialla (B). Immagini di esempio binarie e scheletrate con (C) e senza (D), il protocollo applicato come descritto. Dati di riepilogo della microglia endpoint/cella e processo di lunghezza/cella in illeso (bianco) e ferito il tessuto corticale (grigio) con (E) e senza (F) il protocollo applicato. Analisi statistica utilizzando dello studente test t e n = 3, * * denota p < 0.01. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5. Differenze di utente con applicazione protocollo. Un esempio di un’originale immagine e protocollo conversione immagini binarie e scheletro di utente 1 e utente 2. Differenze tra le due immagini sono evidenziate con i cerchi colorati di corrispondenza. Grafici di riepilogo dei dati di lunghezza/cella endpoint/cella e processo di microglia nelle regioni del cervello illeso e feriti dall’utente 1 e utente 2. Analisi statistica con ANOVA e campione dimensione è n = 3; p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella figura 6. Analisi frattale con e senza l’applicazione del protocollo. Esempio di ritagliata microfotografie di microglia nel illeso (A) e (B) nella corteccia ferita con binario corrispondente (C) e le immagini di contorno (D) che risultano con e senza il protocollo applicato. Il guscio convesso associato (blu) e allegando il cerchio (rosa) per forme di contorno corrispondenti (E) vengono utilizzati per calcolare la densità di forma, rapporto e circolarità (G) della portata. La casella metodo di conteggio è illustrata in (F) e usata per la dimensione frattale (DB) e lacunarity (λ) calcoli (G). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Cellule di microglia sono finemente sintonizzate per la fisiologia e la patologia all’interno dei loro micro-domini e visualizzare una vasta gamma di morfologie2 in sottile7,14 e lesioni lordo8. L’uso di protocolli ImageJ rende quantificazione di morfologia di microglia accessibile a tutti i laboratori come la piattaforma e plugin sono un’immagine di open source software di elaborazione. Mentre il protocollo descritto si trova sull’elaborazione delle immagini e analisi usando questo software, la consistenza della raccolta dei dati, validità e affidabilità inizia con eccellente IHC e microscopia. Questo protocollo è utilizzato per migliorare binary, scheletro e rappresentazioni di muta di intero microfotografie e singole cellule ma non può prendere il posto di scarsa colorazione IHC e microscopia che si traduce in basso contrasto, offuscata, o immagini distorte. Come un’ulteriore considerazione, si deve prestare attenzione non per appiattire il tessuto cerebrale durante il deposito, prima del sezionamento, che altera irrevocabilmente microglia morfologia. Infine, all’interno di ciascun esperimento, le microglia devono essere imaged utilizzando la stessa scala, nonché il microscopio stesso. Strumentazione, obiettivi e software variano fra microscopi che comporta diverse dimensioni microfotografie nonostante gli stessi obiettivi e cambiare i dettagli così come il numero di celle all’interno di ogni fotogramma. Ad esempio, acquisizione di immagini utilizzando un obiettivo 40x su una Leica SPII genera due volte il numero di cellule e meno dettagli rispetto acquisizione utilizzando una 880 Zeiss. Ciò è particolarmente importante per i dati di cella ramificazione raccolti da tutto il telaio, piuttosto che una singola cella, questo diventa un problema di campionamento dei dati.

In generale, analisi dello scheletro che utilizza l’intero Fotomicrografo precede l’analisi frattale singola cella per due motivi. Determinazione delle cellule ramificazione di tutte le celle in una microfotografia è rapido quando rispetto all’analisi frattale di singola cellula e può essere considerato come uno strumento di screening, se il tempo è un fattore. Inoltre, le immagini binarie derivate durante l’analisi dello scheletro sono utilizzate per analisi frattale. Una volta ripreso, ci sono un numero di passaggi critici che possono influenzare i risultati dell’analisi dello scheletro e introdurre utente-influenza. La procedura di protocollo che è la maggior parte delle variabili tra utenti è passo 4.2 (crescente luminosità dell’immagine) e passo 4.5 (determinazione della soglia). Ove possibile, un numero ottimale per aumentare la luminosità (max o min cursore tra 0 e 255) è determinato e mantenuto costante per tutti gli utenti e le immagini. Dove la variabilità di immagine è grande, l’utente può invece scegliere una luminosità che varia tra le immagini. In alternativa, se le immagini sono luminose e il contrasto è elevato, quindi aumentando la luminosità può essere omesso e la soglia può essere standardizzata utilizzando un filtro di soglia di specialità (ad es., Huang) anziché il valore predefinito più variabile. Una volta ottimizzato, i parametri devono essere rispettati al fine di minimizzare ulteriore utente-influenza.

Un esempio di variabilità di utente è presentato nella Figura 5. I valori dei dati sono stati aumentati di 1 utente contro utente 2 e pertanto sarebbe aumentata variabilità se sia utente 1 e utente 2 ha contribuito alla raccolta dei dati. Un esempio delle differenze di utente 1 e utente 2 immagini binarie e scheletrate sono evidenziate dai cerchi colorati (Figura 5). In questo caso, entrambi gli utenti sono stati brevemente addestrato gli studenti universitari con limitata esperienza in microglia. Regolare supervisione e mentoring da un’esperta con protocollo aumentata formazione2 microglia può ridurre la variabilità inter-utente. Anche se non valutato qui, analisi frattale sono meno soggetto a variabilità inter-utente perché cellule binarie sono manualmente e singolarmente isolate da una microfotografia, piuttosto che fare affidamento esclusivamente sulla soglia per determinare forme di microglia. Tuttavia, tutti i metodi di possiedono alcuni variabilità tra gli utenti. Di conseguenza, un singolo utente (idealmente, allenato da qualche competenza in cellule di microglia) dovrebbe completare la raccolta dei dati per un intero set di dati.

Ulteriori modifiche possono essere fatto facilmente al presente protocollo e dipenderanno dalla qualità dell’immagine e gli sforzi compiuti per ridurre rumore e garantire la connettività di processo. Ad esempio, se il contrasto è adeguato, maschera di contrasto non è necessario e può essere omesso. È prudente ottimizzare e finalizzare il protocollo per un insieme specifico di immagini, sia sperimentali casi e controlli, prima della raccolta dei dati da un intero set. Infine, i plugin aggiuntivi possono essere utilizzati al posto di altri per chiarire o affinare le immagini che non sono stati descritti nel presente protocollo come dilatare o affilare.

Vantaggi di questo protocollo sono l’universale disponibilità e adattabilità. Inoltre, valutare la ramificazione di cella utilizzando AnalyzeSkeleton è rapida e applicabili a un intero microfotografia. Un vantaggio dell’approccio di analisi multi-cellula è il focus su un’intera regione, piuttosto che singole cellule. Di conseguenza, è possibile valutare rapidamente la ramificazione media (in termini di endpoint e lunghezza di processo) di tutte le microglia all’interno dell’immagine. Analisi dello scheletro forniscono un’analisi di più celle: un campionamento dei dati in termini di numeri di cellulare che non possono essere eguagliati da analisi frattale dovuto l’investimento di tempo necessario per isolare cellule singole da microfotografie. Un’istanza dove questo potrebbe essere più adatto sarebbe in morfologie di microglia nelle vicinanze per una lesione focale di screening. Una limitazione è il rendering di immagini di tutto il campo per creare modelli di ossatura di IHC microfotografie è imperfetto rispetto all’approccio di singola cellula richiede più tempo. Inoltre, un’analisi della regione non è adeguata alle circostanze dove microglia morfologie sono drasticamente diverse nello stesso campo. Infine, questo metodo di analisi dipende dal numero di celle, un parametro che può differire tra condizioni sperimentali.

Analisi frattale sono condotta su una singola cella e quindi integra l’output dei dati di cella media ramificazione risultanti dall’analisi dello scheletro. Anche se molto più tempo che consumano, questo investimento produce una vasta gamma di dati morfometrici. Cella, ad esempio, densità, rapporto di span, e circolarità dati descrivono la dimensione, l’allungamento e forma del contorno della cella, rispettivamente. Lacunarity e dimensione frattale riassumere la complessità delle cellule e l’eterogeneità di forma, rispettivamente. Una sintesi più approfondita di come ogni parametro viene calcolato e come i dati possono essere interpretati viene fornita nel manuale interattivo16 e tale dettaglio dovrebbe essere considerato in relazione alla domanda di ricerca specifici. I risultati del protocollo descritto negli strumenti sensibili per quantificare i piccoli cambiamenti in morfologie di microglia 2D che possono verificarsi in condizioni fisiologiche e patologiche. L’analisi morfometrica aggiuntive quali solidità, convessità e modulo fattore16,20 potrebbe essere possibile se generare forme 3D.

Adattamento e sviluppo di un protocollo è continuo e guidata dall’utente. È stato esteso da fluorescenza8 a campo chiaro/DAB immagini7 ma non ancora a tessuto incorporato di paraffina. Esso inoltre può essere utilizzato in combinazione con software proprietario come Imaris per un’ulteriore analisi. Questo protocollo può essere applicato ad una varietà di fisiologia e non è limitato alle microglia, ma può essere applicato a qualsiasi cella o tessuto con particolari modelli o forme che possono essere identificate utilizzando metodi IHC. Infine, con dimensione del campione sufficiente, un’analisi multivariata o cluster può essere applicata per stratificare microglia secondo morfologia12,21; si tratta di informazioni significative come morfologia microglia è un indicatore fondamentale delle funzioni di microglia e le risposte ai loro dintorni. L’apprezzamento per la diversità morfologica microglial è importante per comprendere appieno le interazioni neuroni-glia-vascolare durante la malattia e di salute ed in espansione. Crescita in questo campo si arricchisce di protocolli ben sviluppati, facile da usare e riproducibili per quantificare e riepilogare microglia morfologia utilizzando più variabili continue.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio ha ricevuto il sostegno finanziario da NINR (F32NR013611). Vorremmo ulteriormente riconoscere e ringraziare gli sviluppatori di AnalyzeSkeleton(2D/3D) e FracLac (Arganda-Carreras et al e Karperien et al., rispettivamente) senza che l’analisi descritta nel presente documento non sarebbe possibile.

Materials

primary antibody anti-IBA1 Wako  019-19741 rabbit host
Vectashield soft mount Vector Labs H-1000
Secondary antibody Jackson ImmunorResearch 711-545-152 donkey host
4 mL glass vial Wheaton UX-08923-11
Triton X-100 Fisher Scientific  BP151
Sodium Azide (NaN3) Sigma S-8032
glass coverslip Fisher Scientific  12-544-G
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Riferimenti

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Microglia MorphologyImmunohistochemistryImageJSkeleton AnalysisFractal AnalysisNeuroinflammmatoryContinuous VariablesIba1FFT Bandpass FilterUnsharp MaskDespeckleBinarySkeletonize

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Young, K., Morrison, H. Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ. J. Vis. Exp. (136), e57648, doi:10.3791/57648 (2018).
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