Summary

Электросудорожная изъятий в крыс и фракционирование их гиппокампах для изучения захват индуцированные изменения в постсинаптической плотность белки

Published: August 15, 2017
doi:

Summary

Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии для тяжелой депрессии. ECS глобально стимулирует активность в гиппокампе, приводит к synaptogenesis и синаптической пластичности. Здесь мы описываем методы для ECS индукции в крыс и внутриклеточных фракционирование их гиппокампах захват индуцированные изменения в синаптических белков.

Abstract

Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии, наиболее эффективное лечение для тяжелой депрессии. ECS индуцирует обобщенных тоник клонические припадки с низкой смертности и нейрональных смерти и представляет собой широко используется модель экрана анти-эпилептических наркотиков. Здесь мы описываем метод индукции ECS в которой краткий 55-мА ток поставляется для 0.5 s для мужчин крысы 200-250 г веса через электроды клип ухо. Такие двусторонние стимуляции производства стадии 4-5 клонические судороги, которые длились около 10 s. После прекращения острой или хронической ECS большинство крыс, восстановлены быть поведенчески неотличим от липовые «не взятие» крыс. Потому что ECS глобально повышает активность мозга, он также использовался для изучения деятельности зависимые изменения синаптических белков и их воздействие на синаптической силы, используя несколько методов. В частности субцеллюлярные фракционирование постсинаптических плотности (PSD) в сочетании с Западный blotting позволяет для количественного определения обилие синаптических белков в этой специализированной структуре синаптических. В отличие от предыдущих метод фракционирования, который требует большого количества грызунов мозги опишем здесь мелких фракционирование метод, чтобы изолировать PSD от гиппокампах одной крысы, без сахарозы градиентного центрифугирования. С помощью этого метода, мы показывают, что изолированные фракции PSD содержит белки постсинаптической мембраны, включая PSD95, GluN2B и GluA2. Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина были исключены из PSD дроби, демонстрируя успешное PSD изоляции. Кроме того хронические ECS уменьшилось GluN2B выражение в PSD, указав, что наши мелкие PSD фракционирование метод может применяться для обнаружения изменений в гиппокампа PSD белки от одного крыс после генетических, фармакологическим или механических обработок .

Introduction

Электросудорожной терапии был использован для лечения пациентов с основными депрессивных расстройств, включая лекарственно-тяжелой депрессии, биполярной депрессии, болезни Паркинсона и шизофрении1,2. В этой терапии захват генерируется электрические стимула доставляется глава наркотизированных пациентов через надчерепное электроды1,2,3. Повторяющихся администрация ECS была клинически полезным лекарственно-депрессивные расстройства1,2,3. Однако точный механизм, лежащий в основе долгосрочной эффективности антидепрессивный эффект в организме человека остается недостижимой. ECS животной модели электросудорожной терапии и широко используется расследовать его терапевтический механизм. Грызунов острый ECS и лечение хронических ECS поощрять взрослых нейрогенез в гиппокампах и реорганизовать нейронной сети4,5, который может вносить усовершенствования в когнитивной гибкости. Кроме того глобального повышения активности мозга, ECS изменяет обилие стенограммы, такие, как мозг производные нейротропные фактор6и несколько белков, включая Метаботропные глутамата приемного устройства 17 и N-метил D-аспартат (NMDA) типа глутамата рецептор субблоков7. Эти изменения участвуют в посреднических долгосрочные изменения числа синапсов, структуры и силы в гиппокампе7,8,9.

В моделях ECS электрической стимуляции доставляется грызунов через stereotaxically имплантированных электродов, роговицы электродов или уха электроды вызывают обобщенных тонизирующий клонические судороги10,11. Стереотаксического имплантация электродов предполагает хирургии и требует значительного времени для улучшения экспериментатора хирургических навыков для сведения к минимуму ущерба. Менее инвазивные роговицы электродов может вызвать сухость и роговицы ссадины и требует анестезии. Использование электродов клип ухо обходит эти ограничения, потому что они могут быть использованы на грызунов без хирургического вмешательства или анестезии и вызвать минимальной травмы. Действительно мы обнаружили, что текущий доставлены к просыпаются крыс через электроды клип ухо надежно индуцирует стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги и изменяет синаптических белков в их гиппокампах10.

Для изучения ECS-индуцированных обилием синаптических белков в регионах конкретных мозга грызунов, важно выбрать экспериментальные методы, которые являются наиболее подходящими для их обнаружения и количественного определения. Субцеллюлярные фракционирование головного мозга позволяет для сырой изоляции растворимые белки цитозольной; Мембранные белки; органеллы границы белков; и даже белки в специальных внутриклеточных структур, таких как PSD12,,1314. PSD — густой и хорошо организованной субцеллюлярные домен в нейроны, в которых сконцентрированы на и вблизи постсинаптической мембраны12,13,15синаптических белков. Изоляция PSD является полезным для изучения синаптических белков обогащенного в PSD, поскольку динамические изменения в изобилии и функции рецепторов постсинаптической глутамата, леса белков и белков трансдукции сигнала в PSD12 , 15 , 16 , 17 коррелируют с синаптической пластичности и synaptopathy наблюдается в нескольких неврологических расстройств17,18. Предыдущих субцеллюлярные фракционирование метод, используемый для очистки PSD участие изоляции моющих средств нерастворимые дроби от сырой мембранные часть мозга, дифференциального центрифугирования сахарозы градиенты14, 19. Основная проблема с этим традиционным методом является, что она требует большого количества грызунов мозги14,19. Подготовка 10-20 грызунов изолировать PSD фракция за лечение требует обширных стоимости и времени инвестиций и не является практически осуществимым, если есть много лечения.

Чтобы преодолеть эту проблему, мы адаптировали более простой метод, который непосредственно изолирует PSD фракции, без сахарозы градиентного центрифугирования20,21и внес в него должна применяться к PSD изоляции от гиппокампах одного крыса мозг. Наши мелкие метод фракционирования PSD дает о 30-50 мкг PSD белков из 2 гиппокампах, достаточных для использования в нескольких биохимических анализов, включая иммунопреципитации и Западный blotting. Западный blotting демонстрирует успех нашего метода для изоляции PSD, раскрывая обогащения постсинаптических плотность белка 95 (PSD-95) и исключение Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина. Наши ECS индукции и мелких PSD фракционирование методы легко приспосабливаются в другие регионы грызунов мозга и относительно простой и надежный способ для оценки воздействия ECS на экспрессию белков PSD.

Protocol

Все экспериментальные процедуры, включая животных темы были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в Университете Иллинойса в Урбана-Шампейн. 1. поддержание колонии крыс Порода крысах Sprague-Dawley (см. Таблицу материалы) и сохранят?…

Representative Results

Подробная процедура с использованием представленные здесь, один электрическим током (55 мА, 100 импульсов в секунду для 0.5 s) доставлено через ухо клип электроды индуцированной неповторяющегося стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги у крыс (рис. 1<strong…

Discussion

Здесь мы описываем метод индукции ECS крыс, который вызывает глобальные стимуляции активности нейронов в их гиппокампах. ECS — животное модель электросудорожной терапии, которая клинически используется для лечения наркотиков огнеупорных депрессивных расстройств в людей1<su…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят д-р Эрик C. Bolton за предоставленную нам возможность использовать его центрифуги для фракционирования и д-р Грэм х. Diering в лаборатории д-р Ричард л Huganir в университете Джона Хопкинса для предоставления нам с мелким протоколом для фракционирования PSD.

Materials

Spargue-Dawley rat Charles River Laboratories ECS supplies
A pulse generator Ugo Bsile, Comerio, Italy 57800 ECS supplies
MilliQ water purifying system EMD Millipore Z00Q0VWW Subcellular fractionation supplies
Sucrose Em science SX 1075-3 Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2 SIGMA-ALDRICH 221368 Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) SIGMA-ALDRICH E9884 Subcellular fractionation supplies
HEPES SIGMA-ALDRICH H0527 Subcellular fractionation supplies
Okadaic acid TOCRIS 1136 Subcellular fractionation supplies
Halt Protease Inhibitor Thermo Scientific 78429 Subcellular fractionation supplies
NaVO3 SIGMA-ALDRICH 72060 Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters Fisher Scientific SCGPS05RE Subcellular fractionation supplies
Iris Scissors WPI (World Precision Instruments) 500216-G Subcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dish Fisher Scientific 08-772B Subcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestle VWR 89026-384 Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tube DENVILLE SCIENTIFIC INC.  C2170 (1001002) Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge  Thermo Fisher 75004521 Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL Thermo Fisher #23228 Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL Thermo Fisher #1859078 Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) BIO-RAD #4561086S Western blot supplies
Running Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel BIO-RAD #1658004 Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane  Milipore IPVH00010 Western blot supplies
Transfer Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Tris-base Fisher Scientific BP152-1 Western blot supplies
Glycine Fisher Scientific BP381-5 Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfate SIGMA-ALDRICH 436143 Western blot supplies
Methanol  Fisher Scientific A454-4 Western blot supplies
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module  BIO-RAD #1703935 Western blot supplies
Nonfat instant dry milk Great value Western blot supplies
Multi-purposee rotator  Thermo Scientific Model-2314 Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography Film DENVILLE SCIENTIFIC INC.  E3018 (1001365) Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate  Thermo Scientific 32106 Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processor KONICA MINOLTA SRX-101A Western blot supplies
Name of Antibody
PSD-95 Cell Signaling #2507 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
Synaptophysin Cell Signaling #4329 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-Tubulin Santacruz SC-5286 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2B Neuromab 75-097 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2 Sigma-aldrich Sab 4501295 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEP Santacruz SC-23892 Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 715-035-150 Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 711-035-152 Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

Riferimenti

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine’s scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).

Play Video

Citazione di questo articolo
Jang, S., Jeong, H. G., Chung, H. J. Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56016, doi:10.3791/56016 (2017).

View Video