Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas
Summary
Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsive para la depresión severa. ECS a nivel mundial estimula la actividad en el hipocampo, a sinaptogénesis y plasticidad sináptica. Aquí, describimos los métodos para la inducción de ECS en ratas y para el fraccionamiento subcelular de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en proteínas sinápticas.
Abstract
Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsiva, el tratamiento más efectivo para la depresión severa. ECS induce convulsiones tonico-clónicas generalizadas con baja mortalidad y muerte neuronal y es un modelo ampliamente utilizado para drogas antiepilépticas de pantalla. Aquí, describimos un método de inducción de ECS en que se entrega una breve corriente de 55 mA para 0.5 s para hombre ratas 200-250 g de peso por medio de electrodos clip de oreja. Tal estimulación bilateral producida etapa 4-5 convulsiones clónicas que duró cerca de 10 s. Tras el cese de ECS aguda o crónica, las ratas más recuperadas para ser indistinguible su comportamiento simulado ratas “no crisis”. Porque ECS a nivel mundial eleva la actividad cerebral, también se ha utilizado para examinar alteraciones dependientes de la actividad de proteínas sinápticas y sus efectos en la fuerza sináptica mediante varios métodos. En particular, fraccionamiento subcelular de la densidad postsináptica (PSD) en combinación con Western Blot permite la determinación cuantitativa de la abundancia de proteínas sinápticas a esta estructura sináptica especializada. En contraste con un método de fraccionamiento anterior que requiere gran cantidad de cerebros de roedores, se describe aquí un método de fraccionamiento en pequeña escala para aislar el PSD desde el hipocampo de una rata sola, sin centrifugación gradiente de sacarosa. Usando este método, nos muestran que la fracción aislada del PSD contiene proteínas de la membrana postsináptica, incluyendo PSD95, GluN2B y GluA2. Sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina fueron excluidos de la fracción PSD, demostrando el aislamiento exitoso de PSD. Además, ECS crónica disminuyó la expresión de GluN2B en PSD, lo que indica que nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala puede aplicarse para detectar los cambios en las proteínas PSD hipocampales de una rata sola después de tratamientos genéticos, farmacológicos o mecánicos .
Introduction
La terapia electroconvulsiva se ha utilizado para tratar a pacientes con trastornos depresivos mayores, incluyendo depresión severa resistente a los medicamentos, depresión bipolar, enfermedades de Parkinson y esquizofrenia1,2. En esta terapia, crisis es generada por estímulos eléctricos a la cabeza de los pacientes anestesiados vía epicranial electrodos1,2,3. Administración repetitiva de ECS ha sido clínicamente beneficiosa para los trastornos depresivos resistentes a los medicamentos1,2,3. Sin embargo, el mecanismo exacto subyacente la eficacia a largo plazo del efecto antidepresivo en los seres humanos ha permanecido elusivo. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva y es ampliamente utilizada para investigar su mecanismo terapéutico. En roedores, ECS aguda y crónica tratamiento de ECS promoción la neurogénesis adulta en el hipocampo y reorganizan la red neuronal4,5, que es probable que contribuyen a las mejoras en la flexibilidad cognitiva. Además, la elevación global de la actividad cerebral por ECS altera la abundancia de las transcripciones, como un cerebro derivada factor neurotrópico6y varias proteínas, incluyendo metabotrópicos glutamato receptor 17 y la N-metil-D-Aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades7. Estos cambios están involucrados en mediar modificación a largo plazo del número de sinapsis, estructura y fuerza en el hipocampo7,8,9.
En modelos ECS, estimulación eléctrica se entrega a los roedores mediante electrodos implantados stereotaxically, electrodos corneales o electrodos de oído evocar convulsiones tonico-clónicas generalizadas10,11. Implantación estereotáctica de electrodos consiste en una cirugía de cerebro y requiere un tiempo considerable para mejorar las habilidades quirúrgicas del experimentador para minimizar el daño. Menos invasivos electrodos corneales pueden causar sequedad y abrasión corneal y requieren anestesia. El uso de electrodos clip de oreja omite estas limitaciones ya que pueden ser utilizados en roedores sin cirugía ni anestesia y causar lesión mínima. De hecho, encontramos que actual ratas entregado a despierto a través de clip de oreja electrodos confiablemente induce convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5 y altera las proteínas sinápticas en sus hipocampos10.
Para examinar la abundancia ECS-inducida de proteínas sinápticas en las regiones específicas del cerebro de los roedores, es importante elegir los métodos experimentales que son los más adecuados para su detección y cuantificación. Fraccionamiento subcelular del cerebro permite el aislamiento crudo de proteínas solubles del citosol; proteínas de membrana; proteínas orgánulo-límites; e incluso las proteínas en especiales estructuras subcelulares, tales como el PSD12,13,14. El PSD es un dominio subcelular densa y bien organizado en las neuronas en que las proteínas sinápticas están concentradas en y cerca de la membrana postsináptica12,13,15. El aislamiento de la PSD es útil para el estudio de las proteínas sinápticas enriquecido en el PSD, desde cambios dinámicos en la abundancia y la función de receptores de glutamato postsinápticos, proteínas de andamiaje y proteínas de transducción de señal en el PSD12 , 15 , 16 , 17 se correlacionan con la plasticidad sináptica y la synaptopathy observada en varios trastornos neurológicos17,18. Un método de fraccionamiento subcelular anterior utilizado para purificar el PSD participando el aislamiento de la fracción insoluble en detergente de la fracción cruda de la membrana del cerebro de la centrifugación diferencial de gradientes de sacarosa14, 19. el gran reto con este método tradicional es que requiere grandes cantidades de roedores los cerebros de14,19. Preparación de roedores 10-20 para aislar la fracción de la PSD por tratamiento requiere amplia costo e inversión de tiempo y no es prácticamente posible si hay muchos tratamientos.
Para superar este reto, hemos adaptado un método más sencillo que directamente aísla la fracción PSD, sin centrifugación del gradiente de sacarosa de20,21y revisada para que sea aplicable al aislamiento de PSD desde el hipocampo de una rata sola cerebro. Nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala produce sobre 30-50 μg de las proteínas PSD de 2 hipocampos, suficientes para el uso en diversos estudios bioquímicos, incluyendo inmunoprecipitación y Western blotting. El borrar occidental demuestra el éxito de nuestro método para aislar el PSD al revelar el enriquecimiento de proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y la exclusión de sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina. Nuestra inducción de ECS y métodos de fraccionamiento de PSD en pequeña escala son fácilmente adaptables a otras regiones del cerebro de roedores y proporcionan una manera relativamente simple y confiable para evaluar los efectos de ECS en la expresión de las proteínas PSD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método de inducción de ECS en ratas que provoca la estimulación global de la actividad neuronal en sus hipocampos. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva, que se utiliza clínicamente para tratar trastornos depresivos refractarios de drogas en los seres humanos1,2,3. A pesar de uso de la terapia electroconvulsiva para tratar la depresión severa, el mecanismo exacto subyacente sigue siendo …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Dr. Eric C. Bolton por permitirnos usar su centrífuga para el fraccionamiento y el Dr. Graham H. Diering en laboratorio del Dr. Richard L. Huganir Universidad de John Hopkins por facilitarnos el protocolo en pequeña escala para el fraccionamiento de la PSD.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
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