Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines
Summary
Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs pour dépression sévère. ECS dans le monde stimule l’activité dans l’hippocampe, conduisant à la synaptogénèse et la plasticité synaptique. Nous décrivons ici les méthodes pour l’induction de ECS chez les rats et pour fractionnement subcellulaire de leur hippocampe pour examiner les changements induits par saisie en protéines synaptiques.
Abstract
Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs, le traitement le plus efficace pour la dépression sévère. ECS provoque des crises tonico-cloniques généralisées avec faible taux de mortalité et de la mort neuronale et est un modèle répandu aux médicaments anti-épileptiques écran. Nous décrivons ici une méthode d’induction de ECS dans lequel un courant 55-mA brève est livré pendant 0,5 s mâle rats poids via des électrodes clip oreille de 200-250 g. Cette stimulation bilatérale produite étape 4-5 crises cloniques qui a duré environ 10 s. Après la cessation des ECS aiguë ou chronique, la plupart des rats récupérés pour être distinguée sur le plan comportemental de simulacre de rats « aucune saisie ». Parce que ECS augmente globalement l’activité cérébrale, il a également servi à examiner des altérations liées à l’activité des protéines synaptiques et leurs effets sur la force synaptique en utilisant plusieurs méthodes. En particulier, fractionnement subcellulaire de la densité postsynaptique (PSD) en combinaison avec le Western Blot permet la détermination quantitative de l’abondance des protéines synaptiques à cette structure synaptique spécialisée. Contrairement à une méthode de fractionnement précédent nécessitant une grande quantité de rongeurs cerveaux, nous décrivons ici une méthode de fractionnement à petite échelle afin d’isoler le PSD de l’hippocampe du rat seul, sans la centrifugation en gradient de saccharose. En utilisant cette méthode, nous montrons que la fraction PSD isolée contienne des protéines de la membrane postsynaptique, notamment PSD95, GluN2B et GluA2. Marqueur présynaptique synaptophysine et tubuline α des protéines cytoplasmiques solubles ont été exclues de la fraction PSD, ce qui démontre la réussite de l’isolement PSD. En outre, ECS chronique a diminué l’expression de la GluN2B dans le PSD, indiquant que notre méthode de fractionnement PSD à petite échelle peut être appliqué afin de détecter les changements dans les protéines PSD hippocampe de rat seul après traitements génétiques, pharmacologiques ou mécaniques .
Introduction
La thérapie par électrochocs a été utilisée pour traiter les patients atteints de troubles dépressifs majeurs, y compris le sévère dépression résistante aux médicaments, dépression bipolaire, maladies de Parkinson et la schizophrénie1,2. Dans cette thérapie, saisie est généré par des stimulus électrique livré à la tête des patients anesthésiés par l’intermédiaire d’epicranial électrodes1,2,3. L’administration répétée d’ECS a été cliniquement bénéfique pour les troubles dépressifs résistants aux médicaments1,2,3. Cependant, le mécanisme exact qui sous-tendent l’efficacité à long terme de l’effet antidépresseur chez l’homme est resté insaisissable. ECS est un modèle animal de la thérapie par électrochocs et est employé couramment pour examiner son mécanisme thérapeutique. Chez les rongeurs, les ECS aiguë et chronique traitement ECS promouvoir la neurogenèse adulte dans l’hippocampe et réorganiser le réseau neuronal4,5, qui sont susceptibles de contribuer à l’amélioration de la flexibilité cognitive. En outre, une élévation globale de l’activité cérébrale par ECS modifie l’abondance des relevés de notes, comme un cerveau dérivé facteur neurotrophique6et plusieurs protéines dont métabotropiques du glutamate récepteurs 17 et la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) type glutamate récepteurs sous-unités7. Ces changements sont impliqués dans la médiation de modification à long terme du nombre de synapses, structure et force dans l’hippocampe7,8,9.
Dans les modèles ECS, stimulation électrique est livrée aux rongeurs stereotaxically implanté des électrodes, électrodes cornéens ou d’électrodes de l’oreille pour évoquer les crises tonico-cloniques généralisées10,11. L’implantation stéréotaxique d’électrodes implique une chirurgie du cerveau et nécessite beaucoup de temps pour améliorer des compétences chirurgicales pour minimiser les blessures de l’expérimentateur. Moins envahissants électrodes cornéens pourraient causer la sécheresse et à l’abrasion cornéenne et nécessitent une anesthésie. L’utilisation d’électrodes clip oreille permet de contourner ces limitations car il peuvent être utilisés sur les rongeurs sans chirurgie ou anesthésie et causer des blessures minimes. En effet, nous avons constaté qu’actuel des rats livré à éveillé par clip oreille électrodes fiable induit 4-5e étape tonico-cloniques modifie les protéines synaptiques dans leur hippocampe10.
Pour examiner l’abondance induite par l’ECS de protéines synaptiques dans les régions spécifiques du cerveau des rongeurs, il est important de choisir les méthodes expérimentales les plus adaptées pour leur détection et la quantification. Fractionnement subcellulaire du cerveau permet l’isolement brut des protéines cytosoliques solubles ; protéines de la membrane ; protéines d’organelle-limites ; et même des protéines dans des structures subcellulaires spéciaux, tels que le PSD12,13,14. Le PSD est un domaine subcellulaire dense et bien organisé dans les neurones, dans lequel les protéines synaptiques sont fortement concentrés à et près de la membrane postsynaptique12,13,15. L’isolement de la PSD est utile pour l’étude des protéines synaptiques enrichi à la PSD, depuis les changements dynamiques dans l’abondance et la fonction des récepteurs du glutamate postsynaptique, échafaudage protéines et protéines de transduction de signal dans le PSD12 , 15 , 16 , 17 sont en corrélation avec la plasticité synaptique et la synaptopathy observée dans plusieurs troubles neurologiques17,18. Une méthode de fractionnement subcellulaire précédente utilisée pour purifier le PSD a impliqué l’isolement de la fraction insoluble dans le détergent de la fraction membranaire brute du cerveau par la centrifugation différentielle des gradients de sucrose14, 19. la principale difficulté avec cette méthode traditionnelle est qu’elle requiert de grandes quantités de rongeurs brains14,19. Préparation des rongeurs de 10-20 pour isoler la fraction PSD par traitement exige une vaste coût et temps investi et n’est pas réalisable si il existe de nombreux traitements.
Pour relever ce défi, nous avons adapté une méthode plus simple directement isole la fraction PSD, sans saccharose centrifugation en gradient de20,21et a révisé pour être applicables à l’isolement du PSD de l’hippocampe du rat seul cerveau. Notre méthode de fractionnement PSD petit rendements sur 30 à 50 µg de protéines PSD de 2 hippocampe, suffisante pour une utilisation dans plusieurs essais biochimiques, y compris l’immunoprécipitation et éponger occidental. Éponger occidental démontre le succès de notre méthode pour isoler le PSD en révélant l’enrichissement de la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95) et de l’exclusion du marqueur présynaptique synaptophysine et protéines cytoplasmiques solubles α-tubuline. Notre induction ECS et les méthodes de fractionnement PSD à petite échelle sont facilement adaptables à d’autres régions du cerveau de rongeurs et offrent un moyen relativement simple et fiable pour évaluer les effets des contraceptifs d’urgence sur l’expression des protéines de la PSD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une méthode d’induction ECS chez les rats qui provoque la stimulation globale de l’activité neuronale dans leur hippocampe. ECS est un modèle animal de la thérapie par électrochocs, qui est cliniquement utilisé pour traiter les troubles dépressifs réfractaires de drogue chez les humains1,2,3. Malgré l’utilisation de la thérapie par électrochocs pour traiter la dépression grave, le mécanisme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Dr Eric C. Bolton pour ce qui nous permet d’utiliser sa centrifugeuse pour fractionnement et Dr. Graham H. Diering dans le laboratoire du Dr Richard L. Huganir Université de John Hopkins, pour nous avoir fourni le protocole à petite échelle pour le fractionnement de la PSD.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
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