Summary

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Published: June 22, 2017
doi:

Summary

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。

Abstract

数多くの研究が、中枢神経系(CNS)病変における免疫細胞、特にマクロファージの役割を実証している。 CNSには、(i)CNSの常在マクロファージであり、胚形成中に卵黄嚢前駆体に由来するミクログリア、および(ii)浸潤し得る単球由来マクロファージ(MDM)の2つの主要なマクロファージ集団が、疾患中のCNSは骨髄前駆細胞に由来する。各マクロファージ亜集団の役割は、研究されている病理によって異なる。さらに、これらのマクロファージ亜集団に使用される組織学的マーカーまたは識別基準にコンセンサスはない。しかし、フローサイトメトリーによるCD11bおよびCD45マーカーの発現プロファイルの分析は、我々がミクログリア(CD11b + CD45 med )をMDM(CD11b + CD45 high )から区別することを可能にする。このプロトコルでは、密度勾配遠心分離フローサイトメトリー分析を用いて、これらのCNSマクロファージ亜集団を特徴づけ、最近発表されたこれらの細胞によって発現されるいくつかの興味深いマーカーを研究することができる。従って、この技術は、神経疾患のマウスモデルにおけるマクロファージの役割をさらに理解することができ、これらの細胞に対する薬物効果を評価するためにも使用することができる。

Introduction

ミクログリアは、中枢神経系(CNS)の実質組織に存在するマクロファージである。それらは2つの重要な機能的役割を果たします:免疫防御およびCNSホメオスタシスの維持。骨髄の造血幹細胞から絶えず更新されているMDMとは対照的に、ミクログリア細胞は、胚発生の間に脳に定着した卵黄嚢(YS)に由来する原始造血前駆細胞から分化する1,2,3 。げっ歯類では、転写因子Mybは、骨髄由来の単球およびマクロファージのすべての発生に重要な役割を果たすが、YS由来のミクログリアについては、この因子は不可欠であり、分化は転写因子PU.14に依存する。

健康な中枢神経系において、ミクログリアは、絶えず彼らの環境をスクリーニングする動的細胞である侵入する病原体または組織の損傷のための巣作りおよび調査5 。そのようなシグナルの検出は、傷害を解決するための経路を開始する。ミクログリアは、急速に形態を変化させてアメイボイドに転換し、続いて食作用および炎症性サイトカインなどの様々なメディエーターの貪食および放出が起こる。したがって、それらの微小環境に依存して、活性化ミクログリアは、異なるプライミング状態のスペクトルを獲得することができる6

ミクログリアは、多くの神経障害の発症および進行に深く影響する。アルツハイマー病(AD) 7 、筋萎縮性側索硬化症(ALS) 8 、多発性硬化症(MS) 9またはパーキンソン病(PD) 10のげっ歯類モデルにおいて、ミクログリアは有害な神経毒性を誘発するか、神経保護的な様式で、これは依存性である特定の疾患、病期、およびその病気が全身性免疫コンパートメント7,8,9,10,11の影響を受けているかどうかを判定した。上記の疾患において観察されるCNS病変の大部分は、実質性小膠細胞だけでなく、血管周囲および髄膜マクロファージならびにCNS浸潤性MDMを含む骨髄系細胞の異種集団を含む。これらの細胞型は、傷害および修復に関連する病態生理学的機構に示差的に寄与する可能性がある7,12,13,14,15。これらの疾患モデルを研究している研究者の現在の課題は、末梢単球およびマクロファージがCNSに浸潤するかどうかを確かめることであり、そうであれば、distこれらの細胞から常在性小膠細胞を摘出する。実際、小膠細胞は非常に塑性である。それらが活性化されると、ミクログリアは、通常、末梢単球およびマクロファージによって発現されるマーカーを再発現する。従って、この問題は、常在ミクログリアを浸潤単球およびマクロファージから区別することができるマーカーを同定することに依存する。

免疫組織学的適用による脳切片上のこれらの集団の識別は、特異的抗体の欠如のために制限される。しかし、フローサイトメトリー分析は、いくつかのマーカーの発現を評価し、細胞集団(例えば、リンパ球、マクロファージ/ MDM CD11b + CD45 high 、およびミクログリアCD11b + CD45 med )ならびに細胞亜集団16 17,18 。このプロトコルは、最適化された酵素組織解離および密度勾配遠心分離を用いることによって神経疾患モデルにおいてマウスCNS由来の単核細胞を単離すること;ならびにフローサイトメトリーを用いてCNS中のミクログリアおよびMDM集団を識別するための方法を提供する。

別のアプローチは、特定の抗体19,20,21にコンジュゲートした磁気ビーズを使用することによってミエリンを除去し、細胞を精製することである。抗ミエリン磁気ビーズを使用するミエリン除去は、より高価であり、単離された細胞22の生存率および収量に影響を及ぼす。この段階およびミクログリアの以下の免疫磁気分離は、特定の免疫細胞集団のさらなる研究を制限する21,22

これらの手順は、疾患発症におけるマクロファージ亜集団を研究する簡単な方法を提供し、マクロファージの表現型および活性化状態における薬物効果または遺伝子修飾を決定する。

Protocol

ここに記載されている全ての方法は、ICM研究所の機関動物管理利用委員会とダーウィンフランス倫理委員会によって承認されており、プロトコル01407.02の適用を受けています。 1.準備各マウスのために以下のものを組み合わせることにより、1.5mLチューブで消化カクテルを調製する:1mLリン酸緩衝食塩水(PBS); 13 wunsch / mL(ストック溶液)、最終濃度1.6 wunsch / mL?…

Representative Results

密度勾配遠心分離および抗体染色の後、細胞をフローサイトメーターで取得し、以下のような形態学的ゲーティング戦略を用いて分析した。単一の細胞を二重線から区別するために、ドットプロット前方散乱領域(FSC-A) 対前方散乱高(FSC-H)で第1ゲートを定義した( 図3A )。次いで、相対細胞サイズおよび細胞粒度に基づいて、細胞破…

Discussion

ミクログリアおよびMDMは、CNSにおいて異なる機能および表現型を有することが実証されており、したがって、これらのマクロファージ亜集団の同定および分析は神経疾患9,18,25をよりよく理解するために不可欠である。 2つのマーカー(CD11bおよびCD45)を使用するフローサイトメトリー分析は、各亜集団の間の区別を可能にする( 図3C )。この戦略は、MDMにつ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、Agence Nationale Pour la Recherche(ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD)、Association France AlzheimerおよびBpifranceからの助成金によって支援された。私たちの研究室は、Inserm、CNRS、Pierre et Marie-CurieUniversidéと「Investissements d'avenir」ANR-10-IAIHU-06(IHU-A-ICM)の支援を受けています。 CELIS細胞培養コア施設の支援に感謝したいと思います。

Materials

5-month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01  Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1,5 mL  tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL  tube TPP 91015
50 mL  tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031 
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

Riferimenti

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
  3. Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
  4. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  5. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
  6. Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
  7. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  8. Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  9. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  10. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
  11. Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?. Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson’s disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
  14. Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
  15. Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
  16. Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
  17. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  18. Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer’s disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
  19. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  20. Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
  21. Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
  22. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  24. Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
  25. Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
  26. Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).

Play Video

Citazione di questo articolo
Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

View Video