Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso
Summary
Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.
Abstract
Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo delle cellule immunitarie, in particolare dei macrofagi, nelle patologie del sistema nervoso centrale (CNS). Esistono due principali popolazioni di macrofagi nel CNS: (i) la microglia, che sono i macrofagi residenti del CNS e sono derivate da progenitori di sacchi di tuorlo durante l'embriogenesi e (ii) i macrofagi derivanti da monociti (MDM), che possono infiltrarsi Il CNS durante la malattia e sono derivate da progenitori del midollo osseo. I ruoli di ciascuna sottopopolazione dei macrofagi variano a seconda della patologia studiata. Inoltre, non esiste un consenso sui marcatori istologici o sui criteri distintivi utilizzati per queste sottopopolazioni macrofagi. Tuttavia, l'analisi dei profili di espressione dei marker CD11b e CD45 mediante citometria a flusso ci consente di distinguere la microglia (CD11b + CD45 med ) dall' MDM (CD11b + CD45 alta ). In questo protocollo mostriamo che la centrifugazione di gradiente di densitàE l'analisi della citometria a flusso può essere utilizzata per caratterizzare queste subpopulazioni del macrofago del CNS e per studiare diversi marcatori di interesse espressi da queste cellule come abbiamo recentemente pubblicato. Così, questa tecnica può ulteriormente comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche e può anche essere usato per valutare gli effetti della droga su queste cellule.
Introduction
La microglia sono i macrofagi del tissue-residuo parenchimale del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono due ruoli funzionali chiave: difesa immunitaria e mantenimento dell'omeostasi CNS. In contrasto con l'MDM, che vengono continuamente rinnovate dalle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo, le cellule microgliali si differenziano dalle cellule progenitrici primitive ematopoietiche originate dal sacco di tuorlo (YS) che colonizzarono il cervello durante lo sviluppo embrionale 1 , 2 , 3 . Nei roditori il fattore di trascrizione Myb svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di tutti i monociti e macrofagi derivanti dal midollo osseo, ma per Yglia microglia, questo fattore è dispensabile e la differenziazione rimane dipendente dal fattore di trascrizione PU.1.
Nel sano CNS, microglia sono cellule dinamiche che continuamente esemplare il loro ambiente, scaNning e indagini per l'invasione di patogeni o danni ai tessuti 5 . La rilevazione di tali segnali inizia un percorso per risolvere il danno. La microglia va rapidamente da una morfologia ramificata a quella amoboide, seguita da fagocitosi e rilascio di vari mediatori, come citochine pro o anti-infiammatorie. Pertanto, a seconda del loro microambiente, la microglia attivata può acquisire uno spettro di stati distinti di preparazione 6 .
La microglia influenza profondamente lo sviluppo e la progressione di molti disturbi neurologici. Nei modelli roditori della malattia di Alzheimer (AD) 7 , della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 8 , della sclerosi multipla (MS) 9 o della malattia di Parkinson (PD) 10 , la microglia dimostra di svolgere un ruolo doppio, o indurre neurotossicità dannosa o agire In modo neuroprotettivo, che è dipendente oN la malattia specifica, la fase della malattia e se la malattia è stata influenzata dal vano immunitario sistemico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La maggior parte delle lesioni CNS osservate nelle malattie citate sopra contengono una popolazione eterogenea di cellule mieloide, tra cui non solo microglia parenchimale, ma anche macrofagi perivascolari e meningiali, nonché MDM infiltrante CNS. Questi tipi di cellule possono contribuire in modo differenziato ai meccanismi patofisiologici legati alla lesione e alla riparazione 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . La sfida attuale per gli investigatori che stanno studiando questi modelli di malattia è stabilire se i monociti e i macrofagi periferici si infiltrano nel CNS e, in caso affermativo, a distInguiare la microglia residente da queste cellule. Infatti, le cellule microgliali sono molto plastiche; Quando sono attivati, i marcatori di re-espressione di microglia che sono solitamente espressi da monociti e macrofagi periferici. La questione si basa pertanto sull'individuazione di marcatori che possono distinguere la microglia residente dai monociti infiammatori e dai macrofagi.
La discriminazione di queste popolazioni sulle fette del cervello mediante applicazioni immunohistologiche è limitata a causa della mancanza di anticorpi specifici. Tuttavia, l'analisi della citometria a flusso è una tecnica efficace per valutare l'espressione di diversi marcatori e per distinguere le popolazioni cellulari (ad esempio, i linfociti, i macrofagi / MDM CD11b + CD45 e microglia CD11b + CD45 med ), così come le sottopopolazioni di cellule 16 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive le procedure per l'isolamentoCellule mononucleari del topo CNS nei modelli di malattia neurologica utilizzando una dissociazione tissutale ottimizzata e enzimatica e una centrifugazione di gradiente di densità; Nonché un metodo per differenziare le popolazioni di microglia e MDM nel CNS utilizzando la citometria a flusso.
Un altro approccio è quello di eliminare la mielina e purificare le cellule utilizzando perline magnetiche coniugate a specifici anticorpi 19 , 20 , 21 . La rimozione della mielina usando le perline magnetiche anti-mieline è più costosa e influenza la vitalità e la resa delle cellule isolate 22 . Questo passaggio e la seguente separazione immunomagnetica della microglia, limitano ulteriori studi di popolazioni specifiche delle cellule immunitarie 21 , 22 .
Queste procedure forniscono un modo semplice per studiare le sottopopolazioni dei macrofagi nello sviluppo delle malattie, ePer determinare gli effetti farmacologici o le modificazioni geniche sui fenotipi macrofagi e sugli stati di attivazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato dimostrato che la microglia e l'MDM hanno funzioni e fenotipi diversi nel CNS e quindi l'identificazione e l'analisi di queste subpopulazioni macrofagi sono essenziali per meglio capire le malattie neurologiche 9 , 18 , 25 . L'analisi della citometria a flusso utilizzando due marcatori (CD11b e CD45) consente la distinzione tra ciascuna sottopopolazione ( Figura 3C ). Quest…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agenzia Nazionale per la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), l'Associazione Francia Alzheimer e Bpifrance. Il nostro laboratorio è anche supportato da Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie Curie e il programma "Investigations d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vorremmo ringraziare l'assistenza della centrale CELIS per la coltura delle cellule.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
Riferimenti
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