Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux
Summary
Ce protocole fournit une analyse des sous-populations de macrophages dans le système nerveux central de souris par cytométrie de flux et est utile pour l'étude de marqueurs multiples exprimés par ces cellules.
Abstract
De nombreuses études ont démontré le rôle des cellules immunitaires, en particulier des macrophages, dans les pathologies du système nerveux central (SNC). Il existe deux principales populations de macrophages dans le SNC: (i) la microglie, qui sont les macrophages résidents du SNC et dérivent des progéniteurs du sac vésiculaire pendant l'embryogenèse, et (ii) les macrophages dérivés des monocytes (MDM), qui peuvent infiltrer Le SNC pendant la maladie et sont dérivés de progéniteurs de moelle osseuse. Les rôles de chaque sous-population de macrophages diffèrent en fonction de la pathologie étudiée. En outre, il n'y a pas de consensus sur les marqueurs histologiques ou les critères distinctifs utilisés pour ces sous-populations de macrophages. Cependant, l'analyse des profils d'expression des marqueurs CD11b et CD45 par cytométrie en flux nous permet de distinguer la microglie (CD11b + CD45 med ) du MDM (CD11b + CD45 haute ). Dans ce protocole, nous montrons que la centrifugation à gradient de densitéEt l'analyse par cytométrie de flux peut être utilisée pour caractériser ces sous-populations de macrophages du SNC et pour étudier plusieurs marqueurs d'intérêt exprimés par ces cellules au fur et à mesure de notre publication. Ainsi, cette technique peut favoriser notre compréhension du rôle des macrophages dans les modèles de souris de maladies neurologiques et peut également être utilisée pour évaluer les effets sur ces cellules.
Introduction
Les microglies sont les macrophages résiduels du système nerveux central (SNC) parenchymateux. Ils jouent deux rôles fonctionnels clés: la défense immunitaire et le maintien de l'homéostasie du SNC. Contrairement au MDM, qui sont renouvelés continuellement à partir des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, les cellules microgliales se différencient des cellules progénitrices hématopoïétiques primitifs provenant du sac vellé (YS) qui ont colonisé le cerveau pendant le développement embryonnaire 1 , 2 , 3 . Chez les rongeurs, le facteur de transcription Myb joue un rôle crucial dans le développement de tous les monocytes et macrophages dérivés de la moelle osseuse, mais pour la microglie dérivée de YS, ce facteur est dispensable et la différenciation reste dépendante du facteur de transcription PU.1 4 .
Dans le SNC sain, les microglies sont des cellules dynamiques qui échantillonnent constamment leur environnement, scaEt l'arpentage pour les agents pathogènes envahissants ou les dommages aux tissus 5 . La détection de ces signaux déclenche une voie pour résoudre la blessure. La microglie passe rapidement d'une morphologie ramifiée à une amiboïde, suivie d'une phagocytose et d'une libération de divers médiateurs, tels que des cytokines pro ou anti-inflammatoires. Ainsi, selon leur microenvironnement, la microglie activée peut acquérir un spectre d'états d'amorçage distincts 6 .
La microglie a un impact profond sur le développement et la progression de nombreux troubles neurologiques. Dans les modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (AD) 7 , de la Sclérose latérale amyotrophique (ALS) 8 , de la Sclérose en plaques (MS) 9 ou de la maladie de Parkinson (PD) 10 , la microglie joue un double rôle, induisant une neurotoxicité néfaste ou agissant De manière neuroprotective, qui dépend deN la maladie spécifique, le stade de la maladie et si la maladie a été influencée par le compartiment immunitaire systémique 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La plupart des lésions du SNC observées dans les maladies citées ci-dessus contiennent une population hétérogène de cellules myéloïdes, y compris non seulement la microglie parenchymateuse, mais aussi les macrophages périvasculaires et méningés, ainsi que le MDM infiltrant le SNC. Ces types de cellules peuvent contribuer de manière différentielle aux mécanismes pathophysiologiques liés aux blessures et à la réparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Le défi actuel pour les chercheurs qui étudient ces modèles de maladie est d'établir si les monocytes et les macrophages périphériques s'infiltrent dans le SNC et, dans l'affirmative,Astuce la microglie résidante de ces cellules. En effet, les cellules microgliales sont très plastiques; Lorsqu'ils sont activés, les marqueurs de réticine de microglie sont habituellement exprimés par des monocytes périphériques et des macrophages. La question, par conséquent, repose sur l'identification de marqueurs qui peuvent distinguer la microglie résidante des monocytes et des macrophages infiltrants.
La discrimination de ces populations sur les tranches de cerveau par des applications immunohistologiques est limitée en raison du manque d'anticorps spécifiques. Cependant, l'analyse par cytométrie en flux est une technique efficace pour évaluer l'expression de plusieurs marqueurs et pour distinguer les populations cellulaires (par exemple, lymphocytes, macrophages / MDM CD11b + CD45 haute et microglie CD11b + CD45 med ), ainsi que les sous-populations cellulaires 16 , 17 , 18 . Ce protocole décrit les procédures pour isoler lesDes cellules mononucléaires du SNC de souris dans des modèles de maladies neurologiques en utilisant une dissociation de tissu enzymatique optimisée et une centrifugation en gradient de densité; Ainsi qu'une méthode pour différencier les populations de microglie et MDM dans le SNC en utilisant la cytométrie en flux.
Une autre approche est d'éliminer la myéline et de purifier les cellules en utilisant des billes magnétiques conjuguées à des anticorps spécifiques 19 , 20 , 21 . L'élimination de la myéline à l'aide de perles magnétiques anti-myéline est plus coûteuse et affecte la viabilité et le rendement des cellules isolées 22 . Cette étape et la séparation immunomagnétique suivante de la microglie, limitent les études supplémentaires de populations de cellules immunitaires spécifiques 21 , 22 .
Ces procédures fournissent un moyen simple d'étudier les sous-populations de macrophages dans le développement de la maladie, etPour déterminer les effets des médicaments ou les modifications des gènes sur les phénotypes et les états d'activation des macrophages.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il a été démontré que la microglie et le MDM ont différentes fonctions et phénotypes dans le SNC, et donc l'identification et l'analyse de ces sous-populations de macrophages sont essentielles pour mieux comprendre les maladies neurologiques 9 , 18 , 25 . L'analyse de cytométrie de flux utilisant deux marqueurs (CD11b et CD45) permet la distinction entre chaque sous-population ( Figure 3C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), de l'Association France Alzheimer et de Bpifrance. Notre laboratoire est également soutenu par l'Inserm, le CNRS, l'Université Pierre et Marie-Curie et le programme "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Nous tenons à remercier l'assistance de l'établissement de base CELIS de la culture cellulaire.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
Riferimenti
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