Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em> In Vivo</em> Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias
Summary
O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.
Abstract
A inflamação das vias aéreas é freqüentemente associada a infecções bacterianas e representa um importante determinante da doença pulmonar. A determinação in vivo das capacidades pró-inflamatórias de vários fatores é desafiadora e requer procedimentos terminais, como lavagem broncoalveolar e remoção de pulmões para análise in situ , impedindo a visualização longitudinal no mesmo mouse. Aqui, a inflamação do pulmão é induzida através da instilação intratraqueal do sobrenadante de cultura de Pseudomonas aeruginosa (SN) em camundongos transitórios transgenizados que expressam o gene repórter de luciferase sob o controle de um promotor bovino de IL-8 heteróloga. A expressão da luciferase no pulmão é monitorada por análise de imagem bioluminescente in vivo (BLI) em um período de 2,5 a 48 h após a instilação. O procedimento pode ser repetido várias vezes em 2 a 3 meses, permitindo a avaliação da resposta inflamatória nos mesmos ratos comA necessidade de terminar os animais. Esta abordagem permite o monitoramento de fatores pró e anti-inflamatórios atuando no pulmão em tempo real e parece adequado para estudos funcionais e farmacológicos.
Introduction
Doenças pulmonares crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC) e bronquiectasias, são caracterizadas por inflamação das vias aéreas. A inflamação das vias aéreas é caracterizada por edema, infiltração celular, ativação de linfócitos T e mastócitos, aumento das secreções das vias aéreas e deposição excessiva de colágeno. A FC é uma desordem multissistêmica e sua principal causa de mortalidade e morbidade é a infecção bacteriana do pulmão com aumento da exacerbação pulmonar. O declínio da função pulmonar prevê um resultado significativamente mais desfavorável 1 , 2 , 3 , 4 .
O estado inflamatório do trato respiratório geralmente é observado através da avaliação de marcadores imunológicos recrutados durante o processo inflamatório em material derivado das vias aéreas inferior e superior, como o escarro, que fornece res variávelUlts. Broncoscopias também são realizadas 5 . Os modelos murinos são ferramentas valiosas para investigar a patogênese e a evolução das doenças caracterizadas pela inflamação das vias aéreas e para as quais tratamentos ou curas efetivos ainda não foram identificados. Modelos animais de infecção pulmonar e inflamação têm sido utilizados para estudar a asma e as interações hospedeiro-patógeno, incluindo o papel dos produtos químicos que simulam condições humanas ( por exemplo, exposição ao fumo do cigarro, LPS, elastase, ovalbumina, poli I: C, etc. Bem como combinações do acima) 6 . A medida dos parâmetros relacionados à inflamação requer o sacrifício dos animais, uma vez que são necessárias abordagens invasivas para medir fatores como carga bacteriana, citoquinas nos pulmões e líquido lavado broncoalveolar coletado (BAL). Além disso, os exames histológicos são freqüentemente necessários. A possibilidade de obter informações sobre a cinética de resposta inflamatória requer o uso de numRatos erosos. Portanto, uma técnica que permita obter essa informação sem a necessidade de sacrificar os animais é valiosa em bases técnicas, éticas, econômicas e operacionais.
A IL-8 é um jogador essencial no processo de inflamação, recrutando leucócitos para o tecido inflamado. Representa uma leitura molecular para o estudo da ativação da via inflamatória. MIP-2 e KC podem ser homólogos funcionais de IL-8 humana em camundongos. Os ratos expressam apenas um potencial receptor de IL-8, um homólogo de CXCR2 7 humano , 8 , mas são capazes de modular um promotor de gene de IL-8 heteróloga que conduz um gene repórter. Um modelo murino de inflamação pulmonar foi recentemente desenvolvido após a observação de que uma construção repórter de IL-8 bovina / repórter de luciferase pode ser transactivada em camundongos. Este recurso permite a utilização de imagens de bioluminescência (BLI) para monitorar a resposta inflamatória ao viver umNimals 9 .
Este modelo foi adaptado para estudar a inflamação desencadeada por exoprodutos bacterianos ( por exemplo, LPS ou produtos liberados por estirpes bacterianas) ou TNFalpha 10 , 11 . O processo de descoberta de drogas está focado no desenvolvimento e otimização de moléculas anti-inflamatórias antigas e novas que podem tratar doenças pulmonares, como CF, asma e DPOC. Essas novas entidades químicas devem ser testadas rápida e convenientemente em modelos animais que podem ser vinculados a fenótipos clínicos específicos para facilitar o projeto de ensaios clínicos inteligentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em um trabalho anterior 11 , mostrou-se um contraste entre os marcadores BLI e BAL dependentes de BIL-8-Luc. Baseou-se no grau diferencial de sensibilidade dentro das cepas de mouse 12 . Por esta razão, a primeira aplicação do modelo bIL-8-Luc a uma estirpe de rato diferente requer um estudo inicial da resposta inflamatória, tanto em termos de BLI quanto em marcadores inflamatórios mais padronizados.
A transfecção de ratos causa inflama?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Falsificação Física Fibrosis da Fisicologia Cística # 18/2013, FFC # 29/2015 e pela Liga Italiana de Fibrose Cística através do Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
Riferimenti
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