Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em> In vivo</em> Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen
Summary
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Visualisierung der IL-8-Promotor-abhängigen Entzündungsaktivierung in den Lungen von Mäusen durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Das gleiche Tier kann BLI mehrmals für bis zu zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Auslieferung des Luciferase-Reporter-Konstrukts unterworfen werden.
Abstract
Atemwegsentzündung ist oft mit bakteriellen Infektionen assoziiert und stellt eine wichtige Determinante der Lungenerkrankung dar. Die in vivo- Bestimmung der entzündungshemmenden Fähigkeiten verschiedener Faktoren ist anspruchsvoll und erfordert terminale Verfahren wie die bronchoalveoläre Spülung und die Entfernung von Lungen für die In-situ- Analyse, wobei die Längsvisualisierung in derselben Maus verhindert wird. Hier wird die Lungenentzündung durch die intratracheale Instillation von Pseudomonas aeruginosa Kulturüberstand (SN) bei transient transgenisierten Mäusen induziert, die das Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle eines heterologen IL-8-Rinder-Promotors exprimieren. Die Luciferase-Expression in der Lunge wird durch in vivo- Biolumineszenzbild (BLI) -Analyse über einen Zeitabschnitt von 2,5 bis 48 Stunden nach der Instillation überwacht. Die Prozedur kann mehrmals innerhalb von 2 – 3 Monaten wiederholt werden, so dass die Auswertung der Entzündungsreaktion bei denselben Mäusen möglich istDie Notwendigkeit, die Tiere zu beenden. Dieser Ansatz erlaubt die Überwachung von pro- und entzündungshemmenden Faktoren, die in der Lunge in Echtzeit wirken und für funktionelle und pharmakologische Studien geeignet erscheinen.
Introduction
Chronische Lungenerkrankungen wie Asthma, chronisch obstruktive Lungenkrankheit (COPD), zystische Fibrose (CF) und Bronchiektase sind durch eine Atemwegsentzündung gekennzeichnet. Atemwegsentzündung ist gekennzeichnet durch Ödeme, zelluläre Infiltration, T-Lymphozyten- und Mastzellaktivierung, erhöhte Atemwegssekretionen und übermäßige Kollagenablagerung. CF ist eine Multisystem-Störung, und seine Hauptursache für Mortalität und Morbidität ist die lungenbakterielle Infektion mit zunehmender pulmonaler Exazerbation. Der Rückgang der Lungenfunktion prognostiziert ein deutlich schlechteres Ergebnis 1 , 2 , 3 , 4 .
Der Entzündungszustand der Atemwege wird gewöhnlich durch die Auswertung von immunologischen Markern beobachtet, die während des entzündlichen Prozesses in dem von den unteren und oberen Atemwegen abgeleiteten Material, wie z. B. Sputum,Ults Bronchoskopien werden auch durchgeführt 5 . Murine Modelle sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der Pathogenese und Evolution von Krankheiten, die durch eine Atemwegsentzündung gekennzeichnet sind und für die wirksame Behandlungen oder Kuren noch nicht identifiziert wurden. Tiermodelle der Lungeninfektion und -entzündung wurden verwendet, um Asthma- und Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen, einschließlich der Rolle von Chemikalien, die menschliche Zustände simulieren ( z. B. Zigarettenrauchbelastung, LPS, Elastase, Ovalbumin, Poly I: C usw.) Ebenso wie Kombinationen der oben genannten) 6 . Die Messung von entzündungsbezogenen Parametern erfordert das Opfer der Tiere, da invasive Ansätze erforderlich sind, um Faktoren wie Bakterienbelastung, Zytokine in der Lunge und gesammelte bronchoalveoläre Spülung (BAL) Flüssigkeit zu messen. Auch histologische Untersuchungen sind oft erforderlich. Die Möglichkeit, Informationen über die entzündliche Reaktionskinetik zu erhalten, erfordert die Verwendung von numErous Mäuse. Daher ist eine Technik, die es ermöglicht, solche Informationen ohne die Notwendigkeit zu erhalten, die Tiere zu opfern, auf technischen, ethischen, ökonomischen und operativen Grundlagen wertvoll.
IL-8 ist ein wesentlicher Spieler im Entzündungsprozess und rekrutiert Leukozyten an das entzündete Gewebe. Es stellt eine molekulare Auslesung für die Untersuchung der Entzündungswegaktivierung dar. MIP-2 und KC können funktionelle Homologe von humanem IL-8 bei Mäusen sein. Mäuse exprimieren nur einen potentiellen IL-8-Rezeptor, ein Homolog von humanem CXCR2 7 , 8 , aber sie sind in der Lage, einen heterologen IL-8-Genpromotor zu modulieren, der ein Reportergen antreibt. Ein Lungenentzündungsmurinmodell wurde kürzlich nach der Beobachtung entwickelt, dass ein Rinder-IL-8-Promotor / Luciferase-Reporter-Konstrukt in Mäusen transaktiviert werden kann. Diese Funktion ermöglicht die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) zur Überwachung der entzündlichen Reaktion im Leben aNimals 9
Dieses Modell wurde angepasst, um Entzündungen zu untersuchen, die durch bakterielle Exoprodukte ausgelöst wurden ( z. B. LPS oder Produkte, die durch Bakterienstämme freigesetzt wurden) oder TNFalpha 10 , 11 . Der Wirkstoffforschungsprozess konzentriert sich auf die Entwicklung und Optimierung von alten und neuen entzündungshemmenden Molekülen, die Lungenerkrankungen wie CF, Asthma und COPD behandeln können. Diese neuen chemischen Einheiten müssen schnell und bequem in Tiermodellen getestet werden, die mit spezifischen klinischen Phänotypen verknüpft werden können, um das Design von intelligenten klinischen Studien zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
In einer früheren Arbeit 11 wurde ein Kontrast zwischen bIL-8-Luc-abhängigen BLI- und BAL-Markern gezeigt. Es beruhte auf dem differenzierten Grad der Empfindlichkeit innerhalb der Mäusestämme 12 . Aus diesem Grund erfordert die erste Anwendung des bIL-8-Luc-Modells auf einen anderen Mausstamm eine anfängliche Untersuchung der entzündlichen Reaktion sowohl in Bezug auf BLI als auch auf standardisierte entzündliche Marker.
Die Mäusentran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der italienischen zystischen Fibrose-Stiftung Projekt FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 und von der italienischen zystischen Fibrose Liga durch die Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus unterstützt.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
Riferimenti
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