Un modèle de souris transmissible transitoirement IL-8 pour le<em> In vivo</em> Suivi à long terme des réponses inflammatoires
Summary
La méthode décrite ici permet la visualisation de l'activation de l'inflammation dépendante du promoteur de l'IL-8 dans les poumons de la souris par une imagerie bioluminescente non invasive (BLI). Le même animal peut être soumis à BLI à plusieurs reprises pendant jusqu'à deux mois à partir du moment de la livraison de la construction de journaliste de luciférase.
Abstract
L'inflammation des voies respiratoires est souvent associée à des infections bactériennes et représente un déterminant majeur de la maladie pulmonaire. La détermination in vivo des capacités pro-inflammatoires de divers facteurs est difficile et nécessite des procédures terminales, telles que le lavage broncho-alvéolaire et l'élimination des poumons pour une analyse in situ , empêchant une visualisation longitudinale dans la même souris. Ici, l'inflammation pulmonaire est induite par l'instillation intratrachéale du surnageant de culture de Pseudomonas aeruginosa (SN) chez des souris transitoires transitoires exprimant le gène rapporteur de la luciférase sous le contrôle d'un promoteur bovin IL-8 hétérologue. L'expression de la luciférase dans le poumon est contrôlée par une analyse de l'image bioluminescente in vivo (BLI) sur un intervalle de temps de 2,5 à 48 heures après l'instillation. La procédure peut être répétée plusieurs fois en 2 à 3 mois, permettant ainsi l'évaluation de la réponse inflammatoire chez les mêmes souris avecLa nécessité de mettre fin aux animaux. Cette approche permet de surveiller les facteurs pro et anti-inflammatoires agissant dans le poumon en temps réel et semble approprié pour les études fonctionnelles et pharmacologiques.
Introduction
Les maladies pulmonaires chroniques, comme l'asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la fibrose kystique (FC) et la broncheectasie, se caractérisent par une inflammation des voies aériennes. L'inflammation des voies respiratoires se caractérise par un œdème, une infiltration cellulaire, une activation des lymphocytes T et des mastocytes, une augmentation des sécrétions des voies aériennes et un dépôt excessif de collagène. Les FC sont un trouble multisystémique et sa principale cause de mortalité et de morbidité est l'infection bactérienne pulmonaire par une augmentation de l'exacerbation pulmonaire. Le déclin de la fonction pulmonaire prédit un résultat nettement plus faible 1 , 2 , 3 , 4 .
L'état d'inflammation des voies respiratoires est habituellement observé grâce à l'évaluation des marqueurs immunologiques recrutés pendant le processus inflammatoire dans des matières dérivées des voies aériennes inférieure et supérieure, telles que les expectorations, qui fournissent des rés variablesUlts. Des bronchoscopies sont également effectuées 5 . Les modèles murins sont des outils précieux pour étudier la pathogenèse et l'évolution des maladies caractérisées par une inflammation des voies respiratoires et pour lesquelles des traitements ou des traitements efficaces n'ont pas encore été identifiés. Des modèles animaux d'infection pulmonaire et d'inflammation ont été utilisés pour étudier l'asthme et les interactions hôte-pathogène, y compris le rôle des produits chimiques qui simulent des conditions humaines ( p. Ex., Exposition à la fumée de cigarette, LPS, élastase, ovalbumine, poly I: C, etc. Ainsi que des combinaisons de ce qui précède) 6 . La mesure des paramètres liés à l'inflammation nécessite le sacrifice des animaux, car des approches invasives sont nécessaires pour mesurer des facteurs tels que la charge bactérienne, les cytokines dans les poumons et le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL) collecté. En outre, des examens histologiques sont souvent nécessaires. La possibilité d'obtenir des informations sur la cinétique de réponse inflammatoire nécessite l'utilisation de numDes souris erreuses. Par conséquent, une technique qui permettrait d'obtenir de telles informations sans avoir à sacrifier les animaux est précieuse sur les bases techniques, éthiques, économiques et opérationnelles.
L'IL-8 est un acteur essentiel dans le processus d'inflammation, en recrutant des leucocytes sur le tissu enflammé. Il représente une lecture moléculaire pour l'étude de l'activation des voies inflammatoires. MIP-2 et KC peuvent être des homologues fonctionnels de l'IL-8 humaine chez la souris. Les souris n'expriment qu'un seul récepteur potentiel d'IL-8, un homologue de CXCR2 7 , 8 humain, mais ils sont capables de moduler un promoteur de gène IL-8 hétérologue qui conduit un gène rapporteur. Un modèle murin d'inflammation pulmonaire a récemment été développé après l'observation selon laquelle un promoteur de promoteur IL-8 bovin / révélateur luciférase peut être transactivé chez la souris. Cette fonctionnalité permet l'utilisation de l'imagerie bioluminescente (BLI) pour surveiller la réponse inflammatoire en vivant unNimaux 9 .
Ce modèle a été adapté pour étudier l'inflammation déclenchée par les exoproduits bactériens ( p. Ex. LPS ou produits libérés par des souches bactériennes) ou TNFalpha 10 , 11 . Le processus de découverte de médicaments se concentre sur le développement et l'optimisation de molécules anti-inflammatoires anciennes et nouvelles qui peuvent traiter les maladies pulmonaires, telles que les FC, l'asthme et la MPOC. Ces nouvelles entités chimiques doivent être testées rapidement et commodément dans des modèles animaux qui peuvent être liés à des phénotypes cliniques spécifiques afin de faciliter la conception d'essais cliniques intelligents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans un travail précédent 11 , un contraste entre les marqueurs BLI et BAL de BIL-8-Luc-dependent a été montré. Il s'est appuyé sur le degré différentiel de sensibilité dans les souches de souris 12 . Pour cette raison, la première application du modèle bIL-8-Luc à une souche de souris différente nécessite une étude initiale de la réponse inflammatoire, à la fois en termes de BLI et de marqueurs inflammatoires plus standardisés.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le projet FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 de la Fondation de la fibrose kystique italienne et par la Ligue italienne de la fibrose kystique à travers la Véneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
Riferimenti
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